微生物抗菌素敏感试验

抗菌素敏感试验

一、实验目的

1、掌握药敏试验（K-B 纸片琼脂扩散 法）方法、原理及结果判读 2、掌握抗酸染色方法及结果判定

二、实验原理

1、抗菌药物分类：

（1）β-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类（硫酶素类、单内酰环类、β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类)

（2）氨基糖甙类：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿奇霉素

（3）大环内脂类：红霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素 （4）四环素类：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素 （5）氯霉素类：氯霉素、甲砜霉素

（6）作用于G+细菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽 （7）作用于G-菌的其它抗生素：多粘菌素、磷霉素、、环丝氨酸、利福平、抗真菌抗生素、灰黄霉素

（8）抗肿瘤抗生素：丝裂霉素、放线菌素D 、博莱霉素、阿霉素 （9）具有免疫抑制作用的抗生素：环孢霉素

2、抗菌药物敏感试验(antimicrobial susceptibility testing in vitro ) 1）抑菌试验：体外测定抗菌药物抑制细菌生长能力的试验 （1）纸片扩散法（disc diffusion test）

K-B 纸片琼脂扩散法原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制, 从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度, 并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关。 （2）稀释法（dilusion test）

a. 将被检菌株接种于一组含有不同稀释度抗菌药物的培养基内

b.37℃ 18-24小时后，抗菌药物能抑制被检菌肉眼可见生长的最低浓度（MIC ）即该菌对该抗菌药物的敏感度 c.MIC 50 MIC90

d. 根据MIC 和常用剂量时该药所能达到的血药浓度来划定细菌对各种药物的敏感度或耐药的界限（break point,折点)

（3）E 试验法（E test） 2）杀菌实验 3）联合药敏试验

4）检测细菌所产生的抗生素灭活酶试验 3、药物敏感性分级 1）敏感（S ）

表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭 2）中介度（I ）

在敏感与耐药之间建立缓冲带，以减少因各种实验条件失控对实验结果的影响 3）耐药（R ）

表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制 4、结核分枝杆菌：

（1）形态与染色：菌体细长略弯曲、有的呈分枝，抗酸染色阳性-抗酸杆菌，诱导可变为L 型（Much ）

（2）培养特性——馋、懒、丑：专性需氧(obligate aerobes )、营养要求高——罗氏培养基、生长缓慢、固体培基—粗糙、菜花状、 液体培基—表面生长成菌膜。 （3）抵抗力

三抗：抗干燥、抗酸碱、抗碱性染料 三敏感：湿热、紫外线、70-75%酒精

（4）结核杆菌最常发生毒力和耐药性变异长期用药易发生耐药 （5）M.Tb 的致病性：

疏水性阿拉伯-半乳聚糖-分枝菌酸

索状因子（海藻糖分枝菌酸酯）抑制线粒体呼吸

蜡质D(分枝菌酸与糖肽脂的复合物) ：具有免疫佐剂作用 磷脂-与结核结节的形成有关

硫酸脑苷酯抑制吞噬体与溶酶体融合 5、Acid-fast 原理

1）分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。

2）齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。

三、实验材料

金葡培养液： 3套/桌；接种用棉棒儿： 1支/人； MH 琼脂平板：1块/人；各种抗菌纸片：3套/桌；镊子：1把/人； Acid-fast 初染剂：1瓶/2人；结核杆菌涂片：1张/人；滤纸：1张/人

四、实验内容

1、抗菌素敏感试验

1）用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）

2）将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH 琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿平板内缘涂抹一周，以取得均匀接种 3）平板加盖室温干燥3分钟

4）无菌操作，用镊子将药敏纸片贴在涂好菌的平板上，各纸片中心相距至少24mm ，纸片距平板内缘应大于15mm

纸片序号对应的药品：1. getamycin 2.erythromycin 3.vancomycin 4.penicillin 5）轻压纸片使之紧贴琼脂表面

6）37℃ 18-24小时后测量抑菌圈直径

2、抗酸实验

1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s~1min；用水冲洗。

3）复染：用碱性美兰溶液复染1min ，用水冲洗后用吸水纸吸干。 4）用油镜观察

五、实验结果

1． 抗菌素敏感试验结果，如下 表1. 不同抗生素抑菌环宽度测量

Penicillin 的抑菌环几乎没有，说明实验室的金葡对于青霉素耐药。 2． 抗酸染色结果

抗酸染色后，可见分支杆菌被染成红色。

六、思考与讨论

影响药敏试验结果的主要因素 1、药物因素 1）药物理化性质

（1）药物溶解性：药品的溶解性决定了其能否在培养基上均匀扩散，难溶的药物无法完全扩散，所得实验结果会小于真实值。

药物稳定性：临床中常用的药物试纸片一般是事先加工好的，极少是现用现做的，所以药品试纸片中药物含量必然受到其稳定性的影响。针对本次实验使用的抗菌药物：

i. 青霉素类在自然条件下是非常不稳定的，如青霉素钠或钾无论在酸性还是在碱性溶

液中都会迅速分解，所以在加工药敏试纸片过程中以及将试纸片放置到培养基上时，溶剂和培养基的PH 值都会造成药物效价的降低和药敏结果的降低。 ii. 红霉素也是一种很不稳定的药物，它在弱碱情况下较为稳定，但是当PH 小于6时

红霉素会很快分解，导致药敏试验结果的降低。

2）药物作用特点

（1）药物抗菌作用机理：临床中的抗菌药物可以简单的分成抑菌药物和杀菌药物两种。杀菌药物产生的抑菌环边沿一般是非常明晰清楚，而抑菌药物产生的抑菌环边沿是模糊的。所以在药敏试验结果判断上，抑菌药物和杀菌药物抑菌环（带）大小很难确定，并且随着培养时间的延长和药物的失效，抑菌药物抑菌环（带）边沿未被杀死的细菌有可能又恢复生长，从而导致抑菌环（带）的进一步缩小。针对本次实验使用的抗菌药物： i. 抑菌药物有：青霉素、红霉素、万古霉素 ii. 杀菌药物有：庆大霉素

（2）作用适宜PH 值：药物的作用强弱存在最适宜的PH 值

（3）药物有效部位：有些药物的抗菌作用是不能通过体外药敏试验来判断的，它们只有在体内进一步分解（或转化）后才能表现出抗菌作用

（4）离子的影响：常用的许多药物可以受到各种离子的影响而导致抗菌作用降低甚至丧失。如许多重金属离子（铜、锌、汞）等可以破坏青霉素钠(或钾) 的活性，使其抗菌作用降低。所以在进行药物敏感性试验时应该选用无离子水和高质量的营养琼脂。

（5）其他因素：药物自身性质影响因素还包括药物蛋白结合率、作用温度等多方面因素。 2、培养基

1）培养基厚度：影响药物扩散，培养基厚度越大药物的抑菌环越小。抑菌试验常用的培养基厚度一般为5mm 左右。

2）用水的质量：主要是矿物质离子的影响，如Ca2+、Mg2+、Al3+等离子，它们可能使某些药物失活。

3）PH 值：影响药物稳定性和活性。。

4）培养基成分：培养基配制浓度较高或融化不良以及厚薄不均等均可能影响药物扩散；培养基中的蛋白质可能和部分蛋白质结合率高的药物结合而影响药敏试验结果。药物蛋白质结合率如：青霉素≧50%、红霉素≧70%；而氨基糖苷类药物结合率却很低（20%左右）。培养基中的杂质的种类也可能在某些方面影响药敏试验的结果。 3、细菌因素

细菌的菌层厚薄（或涂菌的多少）和细菌生长的特性是影响药敏结果的主要因素。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌环就越小，反之抑菌环就越大。有些细菌在培养基上生长时会发生移动（鞭毛运动），当药物失效或培养时间太长，这类细菌有可能向已经形成的抑菌环移动，这也导致抑菌结果判断的失误。 4、试纸片因素

1）药物含量的多少：试纸片上药物含量的多少应该是影响药敏结果的最主要因素。由于纸片法药敏试验本身就是一种定性药物敏感性试验，试纸片含药量没有统一规定，各个生产单位都是根据各自的标准进行加工，所以试纸片药物种类和含量不同判断标准也不同，药物之间没有明确的可比性。目前许多兽药企业自己生产药敏试纸片和产品的药敏试纸片，有的企业为了提高产品的药敏结果而加大产品药敏纸片中药物含量也在所难免，所以通过药敏试验中抑菌环大小来判断细菌对不同药物的敏感性是不严谨的。

2）试纸片材质：试纸材质对药敏试纸片中药物稳定性以及活性有很大影响。加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的定性或定量滤纸，这种滤纸含有杂质少，对药物保存没有太大影响。但是，临床中许多企业加工的是纸片是选用普通纸，这些普通纸用水浸润后一般为碱性或含有大量无机离子，使用普通纸加工的试纸片药物受到很大影响。也有些企业使用薄型的滤纸片，加工过程中药物不可能被滤纸片均匀吸收，试纸片药物含量不均必然导致药敏试验结果的不确定。 5、 培养条件

药敏试验中培养时间的长短、温度的高低等都是影响药敏试验结果的因素。抑菌药物的抑菌环边沿是一个模糊范围，当培养时间过长或药物失效，药物的抑菌环大小也就会发生改变；细菌的移动性在培养时间过长时也会影响试验结果的判断；培养温度的高低可以影响细菌的生长状况，这也间接影响药敏试验的结果。

七、参考资料

《临床纸片法药敏试验结果影响因素的分析》，来自中国禽病网