食品检验补充实验教材

食品理化检验

补充教材

营养与食品卫生学教研室

二零一零年六月

实验三 直接滴定法测定食品中还原糖

（一） 实验目的

掌握直接滴定法测定还原糖的原理；熟悉碱性酒石酸铜溶液的标定、样品前处理及滴定分析等操作方法和各环节的注意事项。

（二）实验原理

将一定量的碱性酒石酸铜甲液（由硫酸铜和次甲基蓝混合配制）和乙液（由酒石酸钾钠、氢氧化钠和亚铁氰化钾混合配制）等量混合，硫酸铜与氢氧化钠作用立即生成氢氧化铜沉淀，再与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜配合物。在加热条件下，还原糖能将酒石酸钾钠铜中的二价铜还原成一价的氧化亚铜。达到终点时，稍过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原为无色。 先用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液，然后用处理好的样品液直接滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液，便可计算待测样品中还原糖量。

（三）仪器与试剂

碱性酒石酸铜甲液：称取15g 硫酸铜（CuSO 4·5H 2O ）及0.05g 次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000 ml 。

碱性酒石酸铜乙液：称取50g 酒石酸钾钠、75g 氢氧化钠，溶于水中，再加入4g 亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml ，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。 乙酸锌溶液：称取21.9g 乙酸锌，加3ml 冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml 。 亚铁氰化钾溶液：称取10.6g 亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100ml 。 葡萄糖标准溶液：准确称取1.0000g 经过96℃±2℃干燥2h 的纯葡萄糖，加水溶解后加入5ml 盐酸，并以水稀释至1000ml 。此溶液每毫升相当于1.0mg 葡萄糖。

盐酸；酸式滴定管；可调电炉。

（四）操作方法

1．样品处理

（1） 乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类：称取约2.50g ～5.00g 固体试样（吸取25.00ml ～50.00ml 液体试样），置于250ml 容量瓶中，加50ml 水，慢慢加入5ml 乙酸锌溶液及5ml 亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30 min ，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。

（2）酒精性饮料：吸取100.0ml 试样，置于蒸发皿中，用氢氧化钠（40g/L）溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的四分之一后，移入250 ml 容量瓶中，加水至刻度。

（3）含大量淀粉的食品：称取10.00g ～20.00g 试样置于250ml 容量瓶中，加200ml 水，在45℃水浴中加热1h ，并时时振摇。取出冷后，以下按（1）自“慢慢加入5 ml乙酸锌溶液„„”起依法操作。

（4）汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100.0ml 试样置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250ml 容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后备用。

2. 标定碱性酒石酸铜溶液

吸取5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及5.0ml 乙液，置于150ml 锥形瓶中，加水10ml ，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9ml 葡萄糖标准溶液，控制在2min 内加热至沸，趁热以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml （甲、乙液各5ml ）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量的质量（mg ）

3. 样品溶液预测

吸取5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及5.0ml 乙液，置于150ml 锥形瓶中，加水10ml ，加入玻璃珠2粒，控制在2min 内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。

4. 样品溶液测定

吸取5.0ml 碱性酒石酸铜甲液及5.0ml 乙液，置于150ml 锥形瓶中，加水10ml ，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml 的试样溶液至锥形瓶中，使在2min 内加热至沸，趁热继续以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。同法平行操作三份，得出平均消耗体积。

（五）计算

样品中还原糖的含量（以葡萄糖计）按下式进行计算。

X =A ⨯250⨯100 m ⨯V ⨯1000

式中：X 试样中还原糖的含量（以葡萄糖计计），单位为克每百克（g/100g）；A 碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于某种还原糖的质量，单位为毫克（mg ）；m 试样质量，单位为克（g ）；V 测定时平均消耗样品溶液体积，单位为毫升（ml ）。

计算结果表示到小数点后一位。

（六）注意事项

1. 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别配制与贮存，用时才混合。

2. 滴定必须在沸腾条件下进行，不能随意摇动锥形瓶，不能把锥形瓶从电炉上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

3. 严格控制滴定操作条件。碱性酒石酸铜溶液的标定、样品溶液预测及样品溶液测定的操作条件应保持一致，包括溶液的用量、锥形瓶规格、电炉功率、滴定速度及终点的判断等都尽量一致。

4. 样品溶液必须进行预测。要求每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约在10ml 左右。当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释，再进行正式测定。当浓度过低时则采取直接加入10ml 样品液，免去加水10ml ，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10ml 样液中所含还原糖的量。

实验四 牛乳酸度、蛋白质和乳脂肪的测定

（一）实验目的

掌握牛乳酸度的概念及其测定方法；掌握改良凯氏定氮法测定牛乳蛋白质的原理、样品消化和蒸馏实验操作；掌握巴布科克法和盖勃氏法测定牛乳脂肪含量的原理。

（二）牛乳酸度的测定

1. 实验原理

正常鲜奶的酸度为16-18。T 。未经消毒的牛乳在存放过程中因细菌分解乳糖产生乳酸，使牛乳的酸度增加，故常用酸度来判断牛乳的新鲜程度。以。T 表示。牛乳的酸度指中和100ml 牛乳中的酸所消耗0.1000molL -1氢氧化钠标准溶液的毫升数。酸度高于18 。T 视为不新鲜乳。

2. 仪器与试剂

锥形瓶 250ml 、定量吸管 25 ml（或10ml ）

0.5％酚酞乙醇溶液

0.1molL -1氢氧化钠溶液

3. 操作方法

精密吸取牛乳25ml （或10ml ）于250ml 锥形瓶中，加入经煮沸冷却后的蒸馏水50ml （或20ml ）及酚酞指示剂数滴，小心混匀。用0.1molL -1氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在1min 内不消失为止，消耗的0.1molL -1氢氧化钠标准溶液毫升数乘以4（或10）即为牛乳的酸度。T 。

4. 计算

牛乳的酸度（。T ）＝

NaOH 的实际浓度NaOH 消耗的毫升数⨯⨯（或410） 0.1牛乳样品的毫升数

（三）蛋白质含量的测定

1. 实验原理

蛋白质中氮的含量比较恒定，一般16％左右，因此可以通过测定蛋白质中的氮的含量而间接测定食品中蛋白质的含量。食品中的蛋白质在浓硫酸的作用下被消化分解成CO 2、H 2O 及（NH 4）2SO 4等无机物。（NH 4）2SO 4与NaOH 作用

形成氨气，并经水蒸汽蒸馏出来，收集于硼酸吸收液中，用已知浓度的标准盐酸溶液滴定硼酸吸收液中的硼酸铵，计算出氮的含量，并经转换后得到食品中蛋白质的含量。

2. 仪器与试剂

改良凯氏定氮器、滴定管 25ml 或微量滴定管、容量瓶 100ml 、凯氏烧瓶 100ml 、电炉 1000W 、塑料量杯 10ml ÷锥形瓶 100ml

0.01 molL-1标准溶液

浓硫酸、硫酸钾、双氧水、2％硼酸溶液、10％硫酸铜溶液、25％氢氧化钠溶液

指示剂：1份0.1％甲基红乙醇溶液与5份0.1％溴甲酚绿乙醇溶液临用混合配成

3. 操作方法

（1）样品消化

精密量取2.00-3.00ml 牛乳放入100ml 凯氏烧瓶中，再加入2-3g 硫酸钾、10％CuSO 4 2-3ml及浓硫酸5ml ，同时做试剂空白。在通风厨内，将凯氏烧瓶以45-60。斜角放在垫有石棉网的电炉上加热消化，烧瓶口可放入一小漏斗以加快回流。在开始消化的前一阶段，注意控制火力，避免产生大量黑色泡沫，待泡沫消失后，加大火力，随时转动烧瓶，使瓶壁上的内容物全部回流入消化液中，消化到溶液澄清透明，沉淀灰白色即可取下冷却（在消化过程中，为了加快消化进程，可加入适量双氧水促进消化，注意必须取下烧瓶并冷却到室温时再加入双氧水）。沿瓶壁缓慢加入10ml 蒸馏水，并混匀放冷后，将烧瓶中的溶液转入100l 容量瓶中，以蒸馏水洗涤烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，待冷却至室温后定容至刻度备用。

（2）蒸馏与滴定

将凯氏整流器的接收管蒸馏洗涤至流出液呈pH 呈中性。向100ml 锥形瓶内加入2％硼酸吸收液10ml ，再加入3滴混合指示剂，将整流器的接收管插入硼酸吸收液的液面以下。向整流器内加入5.0ml 消化液（或试剂空白液），用少量蒸馏水洗涤加液漏斗，然后迅速加入5ml 25%NaOH溶液，立即夹紧连接加液漏斗的橡胶管，加少量水封住漏斗，以防氨气逸出。用酒精灯加热使蒸馏器外室的自来水沸腾产生蒸气，当冷凝管滴出第一滴冷凝水时开始计时，蒸馏5min ，然后

将接收管脱离硼酸吸收液的液面，继续蒸馏1min ，注意冷凝管流出的冷凝液必须的入锥形瓶内。然后用少量蒸馏水冲洗接收管末端的外壁，用pH 试纸检验滴出来的冷却液是否为pH 中性，若仍呈碱性，则继续蒸馏至冷凝液呈中性为止。

以0.01molL -1标准盐酸滴定吸收液，当溶液颜色有淡绿色变为灰白色或微红色时表明滴定达到终点。记录消耗标准盐酸的体积。

4. 计算

蛋白质含量(g /100ml ) =C （V 2-V 1）⨯0.014⨯转换系数⨯100⨯100 V 3⨯V

式中：V 2滴定样液消耗的HCl 毫升数；V 1滴定空白消耗的HCl 毫升数；V 3蒸馏时加入的消化稀释液的体积（5ml ）；V 牛乳的取样体积（ml ）；C 标准盐酸的浓度（molL -1）；0.014 1molL -1盐酸标准液1ml 相当氮的克数。

（四）牛乳脂肪含量的测定

1. 实验原理

用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛乳中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取巴布科克乳脂瓶或盖勃氏乳脂计脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。

本法可用“伏尔明”溶液代替浓硫酸。

2. 仪器与试剂

巴布科克低乳脂瓶：颈部刻度有0.0-8.0%，0.0-10.0%两种，最小刻度值为0.1%。

图1 巴布科克氏乳脂瓶

盖勃氏乳脂计：颈部刻度为0.0-8.0%，最小刻度为0.1%。

图2 盖勃氏乳脂计

乳脂离心机或盖勃氏离心机、恒温水浴锅、标准移乳管（17.6ml ，11ml ）、标准移液管 17.5ml 。

浓硫酸、异戊醇（沸程128－132℃）、无水碳酸钠、乙醇。

伏尔明溶液：9.3g 无水硫酸钠溶于300ml 蒸馏水中，加入27ml 异戊醇及150ml 乙醇，再加入0.025-0.05g 苏丹Ⅲ，混匀而成。

3. 操作方法

（1）巴布科克法

吸取17.6ml 鲜乳，注入巴布科克氏乳脂瓶中，再量取17.5ml 硫酸，沿瓶颈壁缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀的棕色；置乳脂离心机上，以约1000r/min的速度离心5min ，取出加入80℃以上的水至脂肪浮到2或3刻度处，再置离心机中离心1min ；取出后置55-60℃水浴中，5min 后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分率。

伏尔明法 用标准移液管取17.5ml 伏尔明液于乳脂瓶中，然后加入17.6ml 牛乳，用力振摇至蛋白质完全溶解。将乳脂瓶放于65-70℃水浴中，加热5min ，取出擦干，然后以1000rpm 离心5min ，取出乳制瓶，再放入65-70℃的水浴中保温5min ，取出擦干，即读出牛乳脂肪的含量。

（2）盖勃法

在乳脂计中先加入10ml 硫酸（颈口勿沾湿硫酸），

再沿管壁小心地加入混匀

的牛乳11ml ，使样品和硫酸不要混合，然后加1ml 异戊醇，塞上橡皮塞，用布把瓶口包裹住（以防振摇时酸液冲出溅蚀衣着），使瓶口向外向下，用力振摇使凝块完全溶解，呈均匀棕色液体；静置数分钟后瓶口向下，置于65-70℃水浴中放5min ，取出擦干，调节橡皮塞使脂肪柱在乳脂计的刻度内；放入离心机中，以1000r/min的转速离心5min ，取出乳脂计，再置65-70℃水浴中（注意水浴水面应高于乳脂计脂肪层），5min 后取出立即读数，脂肪层上下弯月形下缘数字之差，即为脂肪的重量百分数。

4. 注意事项

（1） 硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化成黑色溶液而影

响读数；过稀而不能使酪蛋白完全溶解，会使测定值偏低或使脂肪层浑浊。

（2） 硫酸除可破坏球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂

肪容易浮出。

（3） 盖勃法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出，并能降低脂肪球的表面张

力，以利于形成连续的脂肪层。

（4） 1ml 异戊醇应能完全溶于酸中，但由于质量不纯，可能有部分析出掺入

到油层，而使结果偏高。因此在使用未知规格的异戊醇之前，应先做试验，其方法如下：

1） 将硫酸、水（代替牛乳）及异戊醇按测定样品时的数量注入乳脂计中，

振摇后静置24小时澄清，如在乳脂计的上部狭长部分无油层析出，认为适用，否则表明异戊醇质量不佳，不能采用。

2） 加热（65-70℃水浴中）和离心的目的是促使脂肪离析。

（5） 巴布科克法中采用17.6ml 标准吸管取样，实际上注入巴氏瓶中的样品只

有17.5ml ，牛乳的相对密度为 1.03，故样品重量为17.5×1.03=18g。巴氏瓶颈的刻度（0-10%）共10个大格，每大格容积为0.2ml ，在60℃左右，脂肪的平均相对密度为0.9，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为

1.2×10×1.9=1.8g。18g 样品中含有1.8 g脂肪，即瓶颈全部刻度表示为脂肪含量10%，每一大格代表1%的脂肪，故瓶颈刻度读数即为样品中脂肪百分含量。

（6） 盖勃法所用移乳管为11ml ，实际注入的样品为10.9ml, 样品的重量为

11.25g ，乳脂计刻度部分（0-8%）的容积为1ml ，当充满脂肪时，脂肪的重量为0.9g, 11.25g 样品中含有0.9g 脂肪，故全部刻度表示为脂肪含量0.9/11.25×100=8%，刻度数即为脂肪百分含量。