生物化学 酪蛋白讲义
实验五 酪蛋白的制备及含量测定
一、实验目的
1. 学习和掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理和方法
2. 学习分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调成4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双链，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm 波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm 的吸光度可用作蛋白质的定量测定。但不同种的蛋白质对280nm 波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异，因此需用同种蛋白质作对照，结果才可靠。在半定量测定和纯蛋白的定量测定时，可用280nm 的光吸收法。
在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A ）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法。
紫外吸收法操作简便快捷，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛。
三、实验仪器及试剂
95%乙醇(配100mL ) 、乙醇-乙醚混合液（V:V=1:1）(配200mL )
0.2mol/L NaOH （配250mL ）
0.2M pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液（配300mL ）: A 液：称NaAc ·3H2O 54.44克，定容至2L 。 B液：称醋酸 12克，定容至1L 。 取A 液1770mL ，B 液1230mL 混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3L 。 1mg/ml标准酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml ，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml 容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml ，保存于冰箱内。用时配制成浓度为1mg/ml的溶液。
牛奶、无水乙醚、离心机、天平、滤纸（Φ=9cm）、表面皿、抽真空泵、抽滤装置（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管，橡皮塞）、40℃水浴、通风柜、紫外分光光度计、试管
四、实验步骤
1、等电点法制备酪蛋白
将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃，将20mL 牛奶加热至40℃，（牛奶和缓冲液预热的目的？）在搅拌下缓慢地加入20mL 预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，用精密pH 试纸调pH 至4.7（如果pH 没有调至4.7，对得率有什么影响？），可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温，4000rpm 离心8min ，弃上清，得酪蛋白粗制品。
用6mL 水洗脱沉淀1次（酪蛋白溶于水吗？），4000rpm 离心5min ，弃上清在沉淀中加入6mL 95％乙醇（乙醇作用？），搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗（什么作用？）中抽滤，用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀1次，最后用乙醚洗涤沉淀1次（乙醚什么作用？在什么环境中使用？），抽干。将沉淀摊开在干净玻璃或培养皿上，风干，得酪蛋白纯品，准确称量，计算含量和得率。（注意含量和得率的区别）
含量（g ％）＝（酪蛋白g ／100mL 牛奶）×100％
得率＝（测得含量／理论含量 ）×100％，理论含量为3.5g/100mL牛乳
2、紫外吸收法测蛋白质含量（这步和上步的关系？上步中制得的酪蛋白是纯品吗？紫外吸收法测得的蛋白质含量准确吗？）
（1）标准曲线的绘制（标准曲线的横纵坐标的单位是什么？1-8号管的横坐标对应的数值是？表中1-8号管的蛋白质浓度数值是怎么得来的? ）
加完混匀后，用紫外分光光度计测A 280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
（2）酪蛋白样品液制备测定
配制酪蛋白含量在0.05～1.25mg/mL(为什么配成这个浓度？怎么配成这个浓度的溶液？) 的待测样液进行吸光值测定。为使酪蛋白溶解，可向样品中加入少量0.2mol/L NaOH，再用蒸馏水洗入100ml 容量瓶中定容。
取待测酪蛋白溶液1.0mL 置试管中，加入蒸馏水3ml ，混匀，（以什么为对照调零？）按上述方法测定280nm 波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测酪蛋白的浓度。
五、实验结果
1、计算酪蛋白含量和得率，并指出实验步骤中会影响得率高低的具体操作。
2、根据紫外吸收法测出1.0mL 样液中酪蛋白的浓度，计算出20mL 牛奶中含有的酪蛋白质量。并进一步计算出根据紫外吸收法得到的酪蛋白含量和得率。
3、比较等电点法制备酪蛋白质量和紫外吸收法计算出的酪蛋白质量，得出结论。