牛精子体外获能后的超微结构变化_刘国艺
第19卷 第1期2002年3月实验动物科学与管理
LABORATORYANIMALSCIENCEANDADMINISTRATIONVol.19 No.1March2002
研究·观察
牛精子体外获能后的超微结构变化
刘国艺 李彦清 倪 江
(哈尔滨医科大学生理教研室,哈尔滨 150086)
(1.中国科学院动物研究所计划生育与生殖生物学国家重点实验室,北京 100080)
1
摘要:用肝素-咖啡因作获能剂对牛冷冻 解冻精子进行体外获能处理,体外培养1h,在透射电镜下观察精子获能后的超微结构变化。结果表明:(1)牛精子顶体内膜和外膜均为双层膜结构;(2)精子获能后顶体囊泡化的形成有多种形式:质膜与顶体外膜融合,双层顶体外膜自身融合,顶体外膜内陷或外突打褶,双层顶体内膜自身融合,顶体内膜外突打褶形成囊泡;而且在同一精子的顶体反应中可同时出现多种囊泡化形式;(3)精子获能后,头部无顶体覆盖的核后区核膜膨胀,并与膨胀的质膜融在一起;(4)精子获能后,尾部质膜膨胀,且主段质膜比中段质膜膨胀明显,这可能与超激活运动有关。关键词:牛精子;获能;超微结构
中图分类号:S858.23 文献标识码:A 文章编号:1006-6179(2002)01-0012-03
精子获能最早是由Austin和Chang分别在大鼠和家兔中发现的。获能是哺乳动物所特有的普遍现
象,它是顶体反应的前奏,而后者又是受精的必要条件。精子获能现象的发现,不仅对受精生物学的研究有重要意义,而且使哺乳动物的体外受精的研究取得了重大突破。八十年代以来,牛体外受精技术取得了巨大进展,而要成功地进行体外受精,精子获能是关键步骤。本研究用肝素-咖啡因诱导牛冷冻 解冻精子获能,观察了精子获能后的超微结构变化。
2 结果
本研究对经肝素-咖啡因获能处理的牛精子,在培养1h后的超微结构变化进行了研究。结果发现,精子获能后培养1h,顶体反应率为52.1%,而对照组仅5.1%,差异显著(P
经获能处理的牛精子,头部质膜膨胀,与顶体分离,甚至脱落下来,尾部中段和主段质膜也膨胀,主段尤为剧烈。在头部,出现多种囊泡化形式,有的精子顶体内膜和外膜共同形成囊泡;有的精子质膜与顶体外膜同步膨胀,两层膜平行,多处发生点状融合共同形成囊泡,并分泌于质膜外;也有精子顶体内膜自身通过外突打褶的方式形成极扁平的大囊泡;还可见顶体外膜内陷或外突打褶形成囊泡,呈串珠状。本研究观察到精子的内膜和外膜都是双层膜结构。除了质膜、顶体膜参与顶体反应的囊泡化外,还有少数精子顶体膜无特异变化,尤其是赤道段无可见变化,而核后区的质膜和核膜均膨胀,并相互混在一起。
对照组的精子虽未经获能处理,也有5.1%的精子发生顶体反应,主要表现在质膜膨胀,顶体外膜自身发生囊泡化。
1 材料和方法
牛冷冻精液解冻后,用含10mmol L咖啡因的
BO液洗涤精子,将精子悬液加入等体积的含20μg ml肝素的BO液中;对照组用BO液洗涤后,将精子悬液加入BO液中,在38.5℃、5%CO2、相对湿度为100%的CO2培养箱中培养。1h后取出,用2.5%戊二醛-1%锇酸固定,丙酮脱水,Epon812包埋,60℃聚合48h,切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,在透射电镜下观察。
收稿日期:2001-12-06
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膨胀,并与膨胀的质膜混在一起。在顶体区,核膜完
3 讨论与小结
3.1 对照组牛精子的顶体反应
不用获能剂,仅用培养液处理能否使精子获能,张嘉保
[1]
好,不参与顶体的囊泡化,从而保证了核的完整。核后区核膜膨胀与顶体反应有何联系还有待于进一步
研究。
3.4 尾部质膜的变化
有研究表明,肝素可以增强精子的运动能力。精子获能后,尾部主段和中段的质膜膨胀,尤其是主段的质膜膨胀很剧烈,甚至完全脱离内侧的纤维鞘。这表明精子获能后不仅头部发生变化,尾部也有变化。由于尾部是精子的运动器官,精子获能后总表现为超激活运动,所以尾部质膜的膨胀与超激活运动有密切关系。Ca在精子获能中起重要作用,是超激活运动所必需的。可以推测,精子获能后,尾部质膜膨胀,Ca通透性增加,尾部微管滑动,影响了精子拍打的频率和振幅,从而导致超激活运动。参考文献:
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2+
2+
[10]
曾用BO液和TALP液洗涤冷冻的牛、马、
驴和绵羊的精子,发现精子对去透明带仓鼠卵的穿
透率极低,而且精子在卵内不能进一步发育,说明仅用培养液洗涤不能使精子获能,必须用获能剂来诱发精子获能。本实验中,对照组的牛精子未经诱导获能,也发生顶体反应,出现精子顶体膜囊泡化现象,这可能是由于精子在冷冻过程中受到一定程度的损伤,经BO液洗涤后,除去了表面的去获能因子而获能,这样的精子的受精能力也不会高。3.2 顶体反应囊泡化特征
精子发生顶体反应时,顶体膜囊泡化有几种形式,目前观点尚不一致。一种观点认为,当精子穿过卵丘细胞层时,顶体外膜便可凹入顶体内而形成一
[2,3]
些膜包小泡,此后失去质膜。另一种观点则认为,小泡的形成是质膜和顶体外膜二者间发生融合而来的。陈大元等在猪、绵羊、地鼠和大熊猫发现顶体囊泡化是精子顶体的双层外膜多位点的自我融合而形成的,质膜并不参与囊泡化。冯怀亮在貉发现顶体内膜也参与囊泡化。从本研究观察到的几种囊泡化现象,我们认为质膜、顶体外膜、顶体内膜都参与囊泡化,而且囊泡化形式是多种:有质膜和顶体外膜发生融合,顶体外膜与内膜融合,顶体外膜内陷或外突打褶,顶体内膜外突打褶,以及顶体内膜或外膜自身融合形成囊泡,而且在同一精子的顶体反应中可以同时现出几种形式的囊泡化。牛精子参与形成囊泡的膜,以及囊泡化的形式与前面几种观点不同,这可能是由于在动物种属间存在差异而导致的。
另外,本实验中观察到牛精子顶体内膜和外膜均为双层膜结构,这与陈大元等羊、猪、地鼠的观察是一致的。3.3 核膜的变化
关于精子获能后核膜的变化尚未见报道。在本实验中,有的精子在头部无顶体覆盖的核后区核膜
[7—8]
[9]
[4—6]
[7—8]
在大熊猫、绵
UltrastructuralChangesofBovineSpermAfterCapacitationinvitro
LIUGuo-yi,LIYan-qing,NIJiang
(DepartmentofPhysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086)
(1.StakeKeyLabofReproductiveBiology,InstituteofZoology,ChineseAcademySciences,Beijing100080)
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Abstract:Bovinefrozensemenwerethawedandcapacitatedinvitrobyheparinandcaffeinefor1h.Theultrastructrual
changesofspermaftercapacitationwereobservedundertransmissionelectronmicroscope.Theresultswereasfollows(1)Bothofthebovinespermacrosomeinnermembraneandoutermembraneweredoublelayered;(2)Therewerevariouspatternsofacrosomeviscularizationafterspermcapacitation,suchasfusionofplasmamembraneandacrosomeoutermembrane,selffusionofthedoublelayeredacrosomeoutermembrane,invaginationofacrosomeoutermembraneorex-trudationandfusionofdoublelayeredacrosomeinnermembrane;furthermoreseveralvesicularizationpatternscouldbeseeninthesamespermacrosomereaction;(3)Aftercapacitation,thepostpartofthespermheadnucleousmembranewithoutacrosomecoveredexpandedandfusedwithexpandedplasmamembrane;(4)Aftercapactiation,thetailmem-braneexpanded,andthemainpieceoftheplasmamembranewasmuchmoreexpandedthanthatofthemidpiecepart,whichmayberelatedwithhyperactivation.
Keywords:Bovinesperm;Capacitation;Ultrastructure
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