2015.沙门氏菌检测

现代食品检验技术实验

实验指导书

食品科学与工程实验室

徐君飞

实验一 食品中沙门氏菌的荧光抗体检验

一、目的与要求

1．学习和掌握免疫荧光检测技术的原理。

2．初步掌握免疫荧光检测技术的操作方法和检测结果的判定。

二、实验原理

抗体与荧光素结合后，并不影响其和相应抗原发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下可观察到荧光，否则，荧光抗体被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。

三、仪器与试剂

1．载玻片 76×26mm，厚 0.8~1.0mm，事先刻好 4×2 个小方格，并编号。先用洗涤剂彻底洗净油污，经滴检察证实无油污，再浸于 95%酒精中备用。

2．盖玻片 22×22mm，厚 0.13~0.17mm，同上洗净，浸于 95%酒精中备用。

3．荧光显微镜。

4．溶液与试剂

磷酸盐缓冲生理盐水：0.01m(pH9.0)PBS-0.85%NaCl；

固定液：按顺序将无水乙醇 60ml、三氯甲烷 30ml 混匀，再加入 36～38%甲醛 10ml、混匀 4℃ 贮存，重复使用次数以不超过三次为宜；

pH 9.0 碳酸盐缓冲甘油：无水 Na2CO3（分子量 105.99）6g、无水 Na2HCO3（84.01）37g 溶于蒸馏水中，加至 100ml，混匀，即成 pH9.0 碳酸盐缓冲液，以此一份加九份甘油混匀即成，4℃，不超过 2 周为宜；

沙门氏菌多价荧光抗体试剂：选用经国家进出口商品检验局批准的以 FITC 标记的沙门氏菌 A-67 全价“OH”免疫球蛋白（或沙门氏菌 A-60 多价“OH” 免疫球蛋白） ，染色时应按试剂所标明的常规染色工作浓度和稀释方法进行稀释后使用。稀释后的荧光抗体试剂臵 4 ℃ 贮存可使用 1 个月左右保持其固有的染色亮度不变。

四、实验步骤

1．试样制备 对规定的直接增菌培养的肉类样品，可采用剪碎法或棉拭涂抹法而不 宜用均质器打碎法，以免细微颗粒过多干扰镜检效果。

2．增菌培养 试样以 SF或 MM 培养基增菌，培养 18 小时左右。

3．涂片、固定、染色

（1）以直径为 2mm的接种环取已接种的最后培养物 1 环，制成较薄的标本涂片，臵于 37℃ 温箱或室温完全晾干后，用乙醇-三氯甲烷-甲醛固定液固定 5~10 分钟，再用 95%乙醇浸洗后晾干（此乙醇以不重复利用三次为宜） 。

（2）将沙门氏菌A-67 全价“OH”免疫球蛋白试剂（染色工作浓度）滴加于各标本涂片上，臵湿盒内经 37℃ 、30 分钟后取出，用 0.01M、pH 9.0PBS 冲去多余的荧光抗体，另换相

同的 PBS 浸洗 10分钟，再以蒸馏水冲洗后晾干。

（3）滴加 pH 9.0 碳酸盐缓冲甘油后，加盖玻片。

4．镜检 先以低倍镜后以高倍镜观察，记录染色亮度与菌量情况等封片。

（1）菌体荧光染色亮度评定标准

++++：黄绿色闪亮荧光，菌体周围及中心轮廓清晰

+++：黄绿色明亮荧光，菌体周围及中心轮廓清晰

++：黄绿色荧光较弱，周围及中心轮廓清晰

+：仅有暗淡的荧光，菌形尚可见

-：无荧光，或菌形不清

（2）结果判定

阳性：菌体荧光亮度达到++～+++菌体形态特征符合沙门氏菌，多数视野中均能检出数 个菌体以上。

疑似阳性：a.菌形符合，荧光亮度在++以上，但单位视野中菌量过少或仅个别视野见到 有部分菌体聚集现象；

b.荧光亮度在++以上， 但菌体荧光不完整或形态不典型；

c.菌形符合，荧光亮度在+～++，但菌量较多且分布较均匀。

阴性：荧光亮度在++以下，且不属于疑似阳性范围者，均为阴性。

五、结果与讨论

1.镜检阴性：报告为“未检出沙门氏菌”，或“未检出亚利桑那菌”或“未检出沙门氏

菌和亚利桑那菌”。

2.镜检阳性：按 ZB-8-83《出口食品沙门氏菌（包括亚利桑那菌）检验方法》继续进行 培养检查，并根据结果作出报告。若培养法与荧光法结果不一致，应以原增菌液重新进行纯 分离培养检查，并根据该结果报告。

3.镜检疑似阳性：以原增菌液重新涂片、染色、镜检，如仍不能确定时，同样以原增菌 液按原方法继续培养检查，并根据培养法检查结果作出报告。

六、实验要点及注意事项

本法对实验中试样制备、增菌培养方法、涂片、染色镜检及溶液试剂的配制、标记抗体的贮存和染色效价测定等各项都有严格规定， 以尽量减少非特异性着染， 避免造成失误。

七、思考题

荧光标记抗体检测标本的制作时将样品增菌液涂在载玻片上，涂片应薄而均匀，干

燥后用化学方法固定，然后进行荧光染色，其固定的目的是什么？

答：固定的目的：①防止被检材料从拨片上脱落；②清除阻止抗原抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片标本固定后，在-20摄氏度下可保存一年，而不是改变其染色性。

固定的原则：①不损伤细胞内的抗原；②不能凝固蛋白质；③不损伤细胞的形态；④固定后

应保持细胞膜的通透性，以便抗体与抗原结合。

由于实验目的不同，须选用不同的固定剂。常用的固定剂有有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙醇，交联剂如多聚甲醛等。