食用菌接种室洁净度的确定

食用菌接种室洁净度的确定

（固体菌种 金针菇）

关于食用菌接种室洁净级别的标准大多数认为以应不超过

10000级为宜即直径90mm 皿—0.5H —30min

空间杂菌数量少，肯定能提高接种的成功率，但相应的投资成本

和管理维护成本也会上升，而在实际生产中却很少有人能做到达

一万级的洁净度（接种箱可达到，除外），本人根据通过对开放

式接种室洁净度进行近200次的检测和对接种后污染情况的调查

表明：以接种污染率最高不超过2%为设计标准，接种室洁净度级

别根据实际需要确定在10万级至30万级较为适宜。

当然，接种室的洁净级别能达到一万级那是更好了，但适

不适宜作为行业标准，还需根据行业发展水平和实际需要而定。

一万级接种室需要根据洁净室的设计理念和标准进行设计、施

工、管理、维护保养，还应配备相应的管理人员和设备维护人员，

不是现有小工厂随随便便就可以搞好的，重要的是相对于30万级

的接种室一万级接种室建设管理维护的成本消耗所带来的成品

率提高效益远高于其增加的投资成本。

通过检测表明，在对接种室进行规范消毒后很容易达到一万

级，但我们需要的环境无菌度是在接种过程能保持这种级别状

态，即使工作人员进行非常规范的更换无菌工作服、风淋后进入接种室，其洁净状态也将在短短几分种之内急剧恶化（在无净化设备对室内空气进行处理的情况下），一万级状态在5分钟之后将变为十万级，10分钟即可达30万级，随着作业时间的延长空间杂菌数还将增加。即使在室内有一定净化设备的条件下，要想一直保持十万级也将非常困难。曾检测过工作人员进入接种室后工作30分钟在不开净化设备时的洁净度，每个培养皿平均菌落数达12个/5min以上，已远超过中国1998GMP 规定的最低标准，无级了，但即使在这样的条件下接种至二小时，最后的接种污染率却也仅在0.5%左右。

食用菌接种室的设计一般参照微生物实验室的标准，但物种的抗性和生产特性毕竟不完全相同，食用菌需要的是纯培养，但并不一定代表需要我们接入的菌物或培养基自身一点杂菌没有，真正能做到这样毕竟好，但在实际生产中却很难做到都这样，因此我们可把标准降一降，只要能保持正常生产，在成品能得到保证的情况下以实际需要出发来制定标准，来指导生产，不需要一味的去求好，求高。是的，也许在这样的低环境条件下接种菌包被带入了杂菌，但这不代表我们的菌包就污染了，不能用了，需知任何菌物都有其一定的抗性，且杂菌也并不是落地就生根，造成危害，它也需要在适合它生长的条件下才能生长发育，。其实在生产中有很多这样的例子，比如毛木耳、平菇的开放式接种，普通的接种账随便熏熏就接种它们的接种成品率也很高，而那样

的条件恐怕得达到一千万级了吧。

所以我认为一般的袋式金针菇生产的接种室洁净度能达到三十万级就可满足要求（小于等于15个/皿*30min)。

第二章 食用菌接种室设计的环境参数

1，净化级别：30万级，以菌落计平均在10~15个/皿*0.5小时（所有菌落并非都是食用菌有害菌，比如金黄色葡萄球菌直径

0.3~1.2微米，一部分可以通过0.5微米高效过滤器，也可在平皿上形成菌落，但它不能在普通食用菌培养基造成危害，即杂菌对生存环境也具有选择性，所以具有针对性的控制食用菌危害菌才更具有现实意义）

2, 类别：食用菌洁净室

3, 气流状态：乱流洁净室，整体气流以不均匀速度呈不平行流动，伴有回流或涡流。

4, 换气次数：5~8次/小时，总换气数＝总风量*出风效率/接种室体积。

5, 静压差：与相邻环境的空气压力差值，不低于5帕，即接种室压力大于缓冲间，缓冲间大于外界。

6, 温度：16~20度

7, 湿度：小于90%

8, 照度：一般照明，70~150lx

9, 布局（人净路线）：辅助区（贮物间, 更衣室）——>接种室外

走道——>人身净化（缓冲间，更换无菌工作服，人手消毒）——>接种室

10, 建筑要求：（六面光）

10.1 材料：表面光滑，耐磨，绝热，不吸湿、透湿，易加工，表面不易附尘土，易去尘，便 宜。

10.2 地面：耐磨，耐侵蚀，易清扫，可采用水磨石，涂料，瓷砖等）

10.3 墙面：不易脏，易清洁，表面光洁，耐冲击，可采用瓷砖，彩钢板，防霉涂料，树脂漆，装配式洁净室壁板等

10.4 吊顶：为减少投资和方便维护普通接种室可不必吊顶，施工可参考墙面。

注意：食用菌接种室所使用材料一定要注意防水，因为接种室相对湿度一般较大，且经常需要用水擦洗和用消毒水冲洗，以防不不防材料的受潮变形或被侵蚀，需要使用石膏是一定要使用防水石膏，且不得作为罩面材料。

11, 造价（仅供参考）

以办公楼作对照 元/平方米

办公楼 500

一万级（生物洁净室）：2200

十万级（生物洁净室）：1900

层流室（骨髓移植）：4500~7800

30万级（食用菌接种室）：小于1200

第三章 设备配置

1, 外置式空气过滤器 必备 9000元/台，定做，作用：对外界新风进行过滤后送入接种室，对室内含杂菌较多的空气进行稀释和补充接种室内氧气。

性能参数：

风量：1000~1500立方每小时

过滤效率：（小于等于0.5微米）99.99% 三级过滤（粗、中、高效过滤器），过滤后空气通过PVC 管道通入接种室，室内根据接种台分布情况，将出风口安置于正对接种操作部位，，使吹出的新风直吹或覆盖接种外，保持局部的高洁净度，出风口可采用散流器或自制出风口（在PVC 封头上进行均匀打孔），关于出风口吊装位置可以有垂直和水平两种安装方法（垂直即出风口吹出的风向与接种台平面垂直，水平相反），我个人认为水平出风要更好些，因为人在接种时，人手、棉塞、菌种、袋口都在上风位，垂直吹出的风易将其上粘附的杂菌直接吹入菌包内，如是水平流则可减少许多，但在净化远端却更易形成涡流（针对整筐接种）。

配置空间：100~150立方

阻力：小于250帕

2, 臭氧机 必备 参考价（10~12克每小时）2500~3000元每台。自制价1500元。（需选购电源、发生片最好是防潮型的，箱体，冷却风扇等要高级的话还要时间继电器或时控开关，二极管等等）

臭气灭菌的好处就不作多说了，自己去百度，就灭菌的实际效果而言，我认为要远远强于目前所用的含氯及其它的化学药剂（烟雾剂时代即将成为历史），重要的是它效果的确不错，使用方便，快速，分解快，对人体危害小，且不污染环境，可谓高效，廉价又环保。接种室必备。用于对接种室的带包空间消毒。

臭氧发生量的选择：根据净化级别和空间大小而定

百级：20ppm

一万级：15ppm

十万级：10ppm

三十万级：7ppm

（1ppm=1.96mg/m3）

臭氧需求量按以下公式自己计算：

W ＝C*V/（1-S ）

W ：需要的臭氧量 克/小时

C ：需要的臭氧浓度 毫克每立方

V ：接种室体积 立方米

S ：臭气工作一小时后的自然衰减率，取0.61

建议按百级标准定购，反正增加不了多少投资，且臭氧机的发生量会随着工作时间的延长减少，买个保险，放心。

3, 自净器 选配 参考价800~1500元每台 对接种室内空气进行循环过滤，滤除室内空气中的杂菌粒子，也可根据需要装配成垂直或水平流的局部净化设备。

技术参数：

1, 净化效率：大于等于99.95%，针对0.5微米尘粒而言

2, 功率：300~600W

3, 电源：220V

4, 风量：800~1500立方米每小时误差20%

5, 风速：0.3~0.6米每秒

6, 滤材：（高效）超细玻璃纤维

7, 过滤级数：二级，粗效，高效（或亚高效）两级过滤

选配台数

1, 根据接种室大小选择。

例设计接种室为50平方，层高3米，要求每小能进行不少于10次的循环过滤，选用风量为1000立方每小时风量的自净器，则需自净器台数为：50*3*10/（1000*0.8）＝1.87, 即至少需要两台自净器。

2, 根据操作台数量选择即每个操作台配置自净器一台，使经过滤后的空气覆盖接种区域，局部洁净度不高于一万级。

4, 电子净化机 选配 参考价4000元每台，原理：第一段为电离段，使微粒带电，第二段为集尘段，使带电微粒沉积在电极板上。在电离段，放电线上加有8100V 的直流正电压，与接地电极之间形成具有很强电位差的不均匀电场。放电线周围产生电晕放电，使流过的空气电离，产生大量正离子和电子。电子移向放电线，正离子则附着在空气中的微粒上，使中性微粒带正电，然后注向集尘段。在集尘段，正、负电极板交替排列。电极板之间有均匀电场。当带正电荷的微粒进入电场后，受库仑力的作用，改变流向，流向并附着在负极板上。

电子式集尘器可以过滤掉10μm以下的大部分颗粒，具有空气阻力低、积尘后阻力变化小且集尘范围广。电子式集尘器过滤效率取决于电场强度、尘粒大小、气流速度等因素。

1、电子式集尘器由电离丝（区）和集尘板（区）组成。电离丝通电产生电晕放电现象（正电压），空气经过电离区时被电离。

2、 集尘区由多组平行的高电压极板和接地极板组成，空气中被电离的颗粒经过集尘区

时，大部分被接地极板吸附。

杂菌被电离后吸附，通过高压进行杀死，主要特点是效率高，阻力小。

选配方法同自净器。

5, 制冷系统 必备 参考价不详 为避免空气的过于流动给接种造成污染，接种室制冷系统宜采用排管式蒸发器进行自然对流冷却。当然在能保证接种室内洁净度在一万级或十万级的情况下，普通的风冷式蒸发器也可，同时也可采用洁净室专用的洁净空调机组（较贵）。建议采用排管式蒸发器，方案如下：

1, 土法：采用地下水作冷却介质，使用无缝钢管或暖气片作冷却蒸发器，投资省，但控温有限。

2, 如采用氨制冷，可用无缝钢管制作成排管蒸发器通入液氨。效果好，制冷快，可利用已有设备。

3, 如采用其它压缩机组制冷的，将风冷式蒸发器改为排管式蒸发器。工质充注量相应增加，其它改动请教专业人员。

不管采用哪种方案都必须做好防水工作，可在蒸发器下安装接水盘，具体不述。

6, 无菌工作服 选配 参考价60元每套 三十万级接种室的宜选用分体式或大褂式无菌工作服，也可配用连体式，但穿作等较为麻烦。无菌工作服要求能阻留人体脱落物，质地应光滑，不产生静电，不脱落纤维和颗粒物。材质一般采用：超细涤纶长丝＋导电纤维。

7, 净手器 选配 参考价400元每台。手部消毒。

8, 干手器 选配 参考价100元每台。烘干手用。

9, 其它略，门的设计。建议使用移动拉门。

接种操作规程

1 杂菌无处不在，接种是一个严格无菌操作的过程，是一个与杂菌作斗争的过程，所有接种操作人员都必须要竖立严格的无菌操作意识，按规程要求进行接种作业。

2 熟练的接种操作技术对接种成功率有着直接影响，所有操作人员都必须尽力提高自己的接种操作技术水平。

3 接种室开放式接种的接种量对接种成功率有着较大的影响，接种量大，菌种覆盖均匀成品率相对较高，接种人员不得贪图简便少接或接入不均。

4 接种室是一个与外界环境相对隔离的区域，人员要同进同出，尽量减少与外界空气的交换。

5 进入缓冲间后更换工作服、鞋、帽，戴口罩。在自动净手器下喷洒酒精对双手进行消毒后，一同进入无菌操作间开始接种作业。 6 进入无菌操作间应先开启电子净机对空间进行净化作业，人员操作需在净化机无菌区域内进行。

7 使用预先配制好的消毒溶液对菌包进行外表消毒，一次性处理完毕待用。消毒时要注意观察菌种有无污染或长势异常。

8 使用75%酒精对双手、接种工具进行擦拭消毒，接种工具擦拭后在酒精灯火焰上来回转动灼烧3~4圈，稍冷却。

9 将菌种拔除棉花塞，并刨去料面上0.5厘米左右的菌种，然后用接种勺将菌种刨碎（小麦粒大小）即打开菌包接入菌种。菌种必须用完一袋处理一袋，每袋菌种使用完毕后接种工具和手都必须重新消毒一次。

10 每袋菌包接入菌种三勺，大约25克。菌包接种孔必须接入菌种，如接种孔有堵塞的可用接种勺向下捅入。接入料面的菌种一定要注意分布均匀，不均匀的可适当摇动使其均匀。

11 接种中，待接种菌包的棉花塞要用右手小指和手掌将其夹住，不得放置于操作台面上。塞回时要在酒精灯火焰上转动一圈后塞入。

12 接好一筐种后，端上架子车前套环棉塞要侧向压倒，切忌压倒时棉花塞触碰到料面，棉花在携带杂菌，常压灭菌很难将其杀灭干净，触碰料面易引起菌包污染。

13 接种操作要力求快速敏捷，尽量减少开袋后菌包在空间的暴露时间。

14 接种时如发现有菌种被污染的要将菌种袋拧紧密封，单独放置，并重新对手和工具进行严格的消毒。

15 接种作业完毕后按《接种室使用规程》要求做好清洁工作。

接种室使用规程

1 接种室分为缓冲间和无菌操作间，均为洁净区域，凡进入此区域者均需遵守本规程。

2 接种室控制温度为18~22℃, 湿度≤90%。

3 无菌操作间无新风过滤系统，操作人员及酒精灯燃烧所需氧气由门缝等处进入，携带杂菌较多，因此与无菌操作间相邻的冷却间、缓冲间、过道都必须保持干净整洁，并定期进行消毒作业。

4 无菌操作间及缓冲间每月应进行一次洁净度的检测，检测方法为：将直径9cm 的培养皿注入PDA 培养基15ml, 灭菌冷却凝固好后，在接种时将培养皿打开暴露30min 后盖上盖，于30~35℃下倒置培养48h 后观察结果。

5 缓冲间设计洁净度为30万级，检测结果培养皿平均菌落数应≤15个，无菌操作间设计洁净度为10万级，培养皿平均菌落数应≤10个。

6 进入接种室应先在缓冲间更换工作服、穿专用鞋、戴工作帽、口罩，头发应用工作帽帽兜兜住，不得批肩或散落。

7 进入接种室严禁随便走动、打闹、高声谈笑，不接听和拨打电话，接种操作时动作要轻柔、快捷。工作服、鞋、帽要勤洗勤换。

8 无菌操作间使用臭氧消毒，消毒前注意将两端的门关闭严实，当菌种、菌包、药品物件等准备妥当后即可开启臭氧机，消毒人员在开启臭氧机后一定要嗅到臭氧腥味并确定臭氧机正常工作后方可离开，每批次消毒时间为2小时，间隔40~60分钟后可进入接种室进行接种作业，最长间隔时间不可超过1.5小时。

9 无菌操作间的洁净度会随着作业时间的延长而降低，接种操作应尽量快速敏捷，一次接种时间不宜超过两小时。

10 机器设备是无菌操作间赖以存在的基础，必须定期的进行维护保养，确保机器有效平稳运行。臭氧机滤网每月清洗一次，电子净化机过滤网、电场每月清洗一次，活性炭网每年更换一次。

11 接种室要同进同出，进出时动作要迅速，进入后马上将门关闭，不可长时间将门打开，致使外界带菌空气过多的进入。接种期间严禁人员进出。

12 接种室两天以上未使用，再次使用前应进行一次密闭空间消毒。保持接种室清洁，接种人员不得将与生产无关的物品带入接种室。 13 接种室配备的消毒液浓度为：酒精70%~75%，甲酚5%，新洁尔灭0.1%~0.2%及按规定配备的其它消毒剂。

14 接种室每批次操作完毕后都必须做好清洁，地板、角落及轨道槽内料渣要打扫干净，无菌操作台及墙壁应用抹布醮取消毒水擦洗干净。地板用消毒水进行拖洗，拖洗后地板上的明水要用吸水拖把吸干。 15 接种室扫帚、拖把、抹布等专室专用，每日扫除的垃圾要及时清走。

16 无菌操作间冷却盘管防水槽每月至少冲洗一次，以防灰尘、杂菌聚积，带来污染隐患。接种室门、玻璃每半月必须擦洗一次。

电子净化机维护保养规程

1 电子净化机随着工作时间的延长，集尘板、过滤网会吸附和聚积微尘、细菌，影响净化、杀菌效果，为保证电子净化机有效平稳运行，应每月进行维护保养。

2 过滤网维护

2.1 拧动盖板螺丝，将净化机盖板打开，抽出过滤网。

2.2 用清水或清洁剂水将过滤网浸泡15分钟，然后冲洗干净并晾干装回原处。

2.3 清洗工作每月进行一次。

3 电场维护

3.1 打开净化机盖板，拨开挡片，按箭头方向取出电场。

3.2 在大塑料桶内放入适量水和清洁剂，将电场浸入水中浸泡15分钟，然后用双手托住电场在水中来回摇动，使聚积在电场上的脏物彻底掉落，不可用刷子或抹布擦洗。

3.3 电场洗净后取出，然后用清水进行冲洗，直至目丝、集尘板上无清洁剂痕迹残留。

3.4 清洗冲净后的电场要站立放置，在阴凉处自然风干，不可在太阳下曝晒。

3.5 检查目丝是否破损或弯曲、断裂，如有更换目丝。

3.6 使用欧姆表检测双高压接点与电场外壳的绝缘是否良好，如有短路现象应及时排除。

3.7 检查完好后，装回原处，盖上盖板即可。

3.8 电场每月清洗一次。

4 活性炭网的维护

4.1 取下电场盖板，将活性炭网抽出。

4.2 换上新的活性炭网，盖上盖板即可。

4.3 活性炭网根据使用情况，每年至少更换一次。

接 种 室 消 毒 方 法

1、接种室每日分两批进行接种，每批接种六车，人员定编为八人。

2、消毒前需先将已挑选好的菌种搬入接种室，准备好接种必须的工具、药品。

3、合上臭氧消毒器电源，用遥控器将其开启，闻到有臭氧腥臭味后人员方可离开。

4、遥控器使用方法：按下“开/关”键，臭氧发生器发出“嘟”的一声，出风口有带臭氧味气体吹出，出风口内有两块电板显现蓝紫色光芒并发出“吱吱”声为正常开启。

5、遥控器程序已预先设定好，在非正常情况下不得随便按动其它键。

6、如在使用遥控器时，按下“开/关”键，臭氧机不工作，可按下“制热”或“制冷”键。其它设定键请不要随便按动。

7、臭氧机消毒时间为两小时，消毒时间到后请在缓冲间直接将臭氧机电源切断即可。

8、臭氧机接种室两台，缓冲间一台，开启时每台都必须依次开启，只有确认臭氧机正常工作后方可离开。

9、消毒人员进出缓冲间进行消毒作业进出必须将门关严，关闭臭氧机时，进出要迅速，尽量避免内外空气的大量交换。

GMP 认证与臭氧

中国食品产业网 （2006年12月5日17:24）

《GMP 》为“Good Manufacture

Practice(逐字汉译为：良好生产规范)”一词的缩写，在我国制药企业系统称之为“药品生产质量管理规范”。《GMP 》作为制药企业指导药品生产和质量管理的规范，在国际上已有40余年历史，在我国仅有十多年历史。

药品生产是一门十分复杂的科学，在从原料到成品的生产过程中，要涉及到许多的技术细节和管理规范。其中任何一个环节的疏忽，都可能导致药品生产不符合质量要求。也就是有可能生产出劣质药品。因此，必须在药品生产全过程中进行全面质量管理与控制来保证药品质量。

实施药品GMP 是对药品生产全过程进行科学的管理的有效手段，是适应WHO （word health

organization ）关于国际贸易中药品质量签证体系的要求，是适应我国加入WT O 后药品生产企业和发展的需要。

我国加入世贸组织后，其成员国的技术含金量高的产品打入中国市场，首先受冲击的是那些技术工艺落后的企业。跨入二十一世纪后，人的思维、企业的经营模式、产品技术含金量、信息的传递、区域之间的交流都将发生很大变化。如果我们企业还是停留在原来的思维观念上，停留在现在的技术水平上，就有可能被市场经济淘汰。现在是我国加入世贸组织的前夜，是药厂进行技术改造向《GMP 》靠拢的前夜，又是《GM P 》认证的前夜，是机遇与挑战并存的时期，企业正处在生存与发展的节点上。有资金有技术有条件的企业应迎着困难大胆探索，发挥优势，对内加强管理，优化品种。对外迅速打开并占领国际市场。即使资金、技术、条件欠缺的企业只要大胆改革创新，走优化强化的路子，也可达到同样的目的。总之，在市场竞争中，只能积极主动处于动态，而不能消极观望处于静态。目前企业应把相当一部分精力放在实施《GMP 》上，争取早日实施认证。

近几年来，我国实施药品GMP 的力度与速度逐年增强与加快。到目前为止，血液制品、粉针剂、大容量注射剂的生产已全部通过GMP 认证。小容量注射剂的GM P 认证工作将于2002年底完成，其它剂型药品的GMP 认证工作正逐步展开。

同时，国家药品监督管理局药监办[2001]89号文明确提出：

1、 2004年6月30日以前，我国药品制剂和原料药的生产必须全部符合G MP 要求并取得认证证书。

2、

自2004年7月1日起，对凡未取得药品制剂或原料药GMP 证书的生产企业，一律撤销其《药品生产许可证》或取消其相应剂型的生产范围，同时撤销其相应药品的生产文号，责令其停止生产。

3、 新开办药品生产企业必须取得药品GMP 证书后方可组织生产。

4、 自本通知下发之日起，凡未取得相应剂开支药品GMP 证书的企业，一律不予以核发新药和仿制药品生产批准文号。

`

要达到GMP 认证要求，微生物的杀灭程序必不可少，而要达到这一要求，臭氧灭菌已体现出传统的化学熏蒸、紫外灯以及加热等方法所不可比拟的优越性。

由于科研院所专家教授和有关行业工程技术人员对臭氧技术应用的探讨、研究，人们对应臭氧的优越性已逐渐认识了解。臭氧具有消毒灭菌力强，不产生残余污染，可直接对空气、生产的原辅材料及设备、工作服等进行消毒灭菌的性能，在医药、电子、化工、光学等工业生产及生物制品、遗传工程等行业中得到广泛的应用。臭氧发生器作洁净室微生物灭活检测结果，验证了臭氧灭菌的显著效果和可靠性，清华大学李汉忠教授在《洁净消毒剂-臭氧》论文中、解放军军事医学科学院消毒研究员刘育京教授在《在电子消毒灭菌器应用推广会议上的报告》、第二军医大薛广波教授、史江等文献中对臭氧灭菌的效果和可靠性作出了肯定的评价。并对臭氧发生器的综合性能给予一致好评。

臭氧的基本性质研究

人类通过对臭氧的研究发现，臭氧具有不稳定特性和很强的氧化能力。臭氧是由一个氧分子（O2）携带一个氧原子（O ）组成，所以它是氧气的同素异形体。臭氧和氧气的不同之处自表一一目了然。

表一 氧和臭氧的主要性质

表一不难看出，与氧气相比，臭氧比重大、有味、有色、易溶于水、易分解。由于臭氧（O3）是由氧分子携带一个氧原子组成，决定了它只是一种暂存形态，携带的氧原子除氧化用掉外，剩余的又组合为氧气（O2）进入稳定状态。所以臭氧工作中没有二次污染产生，给人类的环保需求雪中送炭，这是臭氧技术应用的最大优越性。

臭氧的应用主要是人为的灭菌消毒。这主要是臭氧有很强的氧化能力，氧原子可以氧化细菌的细胞壁，直至穿透细胞壁与其体内的不饱和键化合而夺取细菌生命，它的作用是即刻完成的，臭氧的迅速灭菌效果决定于它的高还原电位，表二列出了人们常用的消毒物质还原电位与臭氧的比较。

表二 氧化还原电位比较

臭氧在灭菌消毒中名列榜首, 成就了它的四大功用：灭菌、氧化、脱色、除味。 6、臭氧的广谱杀菌原理

臭氧几乎对所有病菌、病毒、霉菌、真菌及原虫、卵囊都具有明显的灭活效果，且灭菌时间来说，迅速无比，是氯的300-600倍，紫外线的3000倍。臭氧的灭菌机理，臭氧可破坏病毒衣壳蛋白的四条多肽链并使RNA 受到损伤；Kim 等报告，臭氧作用过程中，可使噬菌体中RNA 被释放，电镜观察可见噬菌体被断裂成小的碎片。还有人认为，臭氧可与细菌细胞壁脂类双键反应，穿入菌体内部，作用于脂蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，从而导致细菌溶解和死亡。

臭氧的灭菌速度和效果是无与伦比的，它的高氧化还原电位决定了它对氧化、脱色、除味方面的广泛应用，有人研究指出，臭氧溶解于水中，几乎能够消杀水中一切对人体有害的物质，比如铁、锰、铬、硫酸盐、酚、苯、氧化物等，还可分解有机物及灭藻等。

臭氧消毒与GMP 验证

一、GMP 验证对臭氧消毒提出的严格要求

GMP(药品生产质量管理规范) 于1962年首先在美国施行，自1969世界卫生组织颁布了GMP 以后，世界大多数国家都根据自己的国情制订了本国的GMP 。我国于1988年由卫生部正式颁发了我国的GMP 。这是我国药品生产企业管理生产和质量的基本法规，具有强制性，在我国，今后凡是没有通过GMP 验证的药品生产企业，就不能进行药品生产。这是一个强大的推动力，推动着我们医药工业的健康发展。GMP 验证工作在卫生部指导下，受到了药品生产企业的高度重视，在我国的GMP 中臭氧消毒方法是被推荐的消毒方法之一，给臭氧消毒的应用带来了前所末有的机遇。

在制药厂，无菌生产环境的提供是药品生产的先决条件。也就是说在药品的生产中，所采用的无菌工艺必须在投产之前，就通过GMP 验证。所以在GMP 验证中臭氧消毒被列入前验证的范畴。事实上，即使在投产以后，对关键性的无菌工艺还需要进行再验证。而且，在洁净室还需要天天做规定的菌检。所以说，在制药厂，消毒是一项无处不在，无时不有的常规基础工作。

众所周知，药品是用来治病的，因此，它对药检的要求很严。表一是GMP 中规定的药品微生物检查要求。

表一：药品的微生物检查要求

为了做到药品的菌检合格，那么，首先要求药品生产的环境是合格的。在制药厂，生产车间(洁净区) 划分为不同的级别。表二是GMP 验证规定的洁净级别的要求。

表二：

洁净级别要求

对不同洁净级别的洁净室，细菌的允许值如表三所示： 表三：细菌允许值

无论用什么消毒方法, 都要达到上述规定，臭氧也不例外。而且，臭氧作为一种取代传统消毒方法手段，人们对它的要求更高更严，而且要更省事，否则，就难以立足. 。

二、传统消毒方法的缺陷和臭氧消毒的特点

传统的消毒方法主要是三种：一是紫外线消毒，二是试剂消毒，三是加热消毒。这些方法已被大多数人们习惯使用，其安全性、可靠性已被长期的实践所确认，人们对它们放心。但是，任何事物都有一分为二的，它们也有各自的缺陷。

紫外线消毒的主要问题在于：它穿透到力小，在紫外线照射不到的地方，消毒效果不好；其杀菌能力随着使用时间的增加而减小，而且，灯管寿命短，更换过于频繁，运行费用高。

化学试剂消毒，如甲醛熏蒸, 操作麻烦，熏蒸时间长，有二次污染物，对人体有一定的危害，做一次甲醛重蒸需要8个小时，残留物附着洁净室的墙壁上，和设备的表面上，需要擦除。在消毒后的几天内，其悬浮粒子数会增加。

加热消毒包括干热和湿热，其缺点是温度高，能耗大，有的物品如某些原材料，仪器仪表，塑料制品等就不宜加热。

以上三种传统消毒方法的弊端是客观存在, 但在没有更好的方法替代之前，人们还只好用它。如果能够做到充分发挥臭氧的优点，弥补上述方法的缺点，就为臭氧消毒进入药品生产开辟了通道。事实上，臭氧消毒确实有它许多独特的优点。

在我国的GMP 验证年里，对臭氧有一段全面的介绍：

“科学研究表明，臭氧具有强烈的杀菌作用。臭氧(03)的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气(02)和单个氧原子(0)；后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死，多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧分子 (02)，不存在任何有毒残留物，故称无污染消毒剂，它不但对各种细菌(包括肝炎病毒，大肠杆菌，绿浓杆菌及杂菌等) 有极强的杀灭能力，而且对杀死霉菌也很有效。”

另外，在我国卫生部1991年颁布的“消毒技术规范”中，对臭氧的杀菌作用，使用范围及使用方法都有明确的规定。其中，对臭氧的杀菌作用作了明确的肯定：“4.12.2杀菌作用：臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁体和芽胞，病毒，真菌等，可破坏肉毒杆菌毒素。臭氧在水中的杀菌速度较氯快。”

以上这些都是我们国家的法规，很有效力，也是我们臭氧工作者进行宣传的依据。

三、臭氧在药品生产中的应用

尽管在我国的GMP 验证中早已推荐了臭氧消毒方法，但臭氧在药品生产中的应用是在近二年才开始热起来。用得比较成功的有以下几个方面：

1．管道容器的消毒

在药品生产中，坛坛罐罐用得很多，分别用管道阀门，仪表联结起来，组成一个生产单元。对它的消毒。传统方法中比较好的是用酒精浸泡。反应罐，贮存罐小的一吨半吨，大的十吨几十吨，都要灌满酒精，酒精用量之多可想而知。消毒完毕后，再将酒精放掉，但在转弯抹角处，仪表阀门的接头处，还会有酒精的残留，去除这些残留酒精，要用氮气吹，直到吹干为止。酒精用量多，消毒时间长，操作过程复杂。用高压蒸汽消毒也存在同样的问题, 都很费力。

现在用臭氧消毒来代替，相对来说要省事得多。具体方法是：将高浓度的臭氧直接打入管道容器，保持臭氧尾气有一定的浓度，就可以达到消毒的的要求。因为是对管道容器进行内表层的消毒，所以臭氧浓度要用得高一点，我们采用的设计浓度大于50pp m 。苏州黎飞制药厂用金葡菌作培养试验，结果是阴性，达到了GMP 验证的要求。

用臭氧对管道容器做消毒的优点非常明显，臭氧发生器可以流动使用，对不同的罐进行消毒，每个生产单元在每次换料前，都可以及时得到消毒，使用效率很高，很方便，不要用那么多的酒精，不要用氮气，也不要用高压蒸汽。所以在制药厂就能够得到推广。

2．利用中央空调净化系统对洁净区的消毒

在制药厂，一般来说，洁净区面积较大，多由中央空调净化系统完成对各洁净区的净化消毒。传统的消毒方法是用甲醛熏蒸，如上所述，甲醛熏蒸的弊病不少，用臭氧消毒来代替是一个好方法。其方法是将臭氧发生器直接放在空调净化系统的风道中，称为内置式臭氧发生器（HA-A 型）。臭氧随着风道的气流，送入各洁净区，对洁净区进行消毒，剩余臭氧吸入回风口，由中央空调带走。也可以将臭氧发生器放在中央空调风道的外面，将臭氧打入中央空调的风道中，然后送到各洁净室，称为外置式臭氧发生器H A-C 型。外置式臭氧发生器安装检修方便，但制造成本要高一点。两种方法消毒效果是一样的。按照卫生部消毒规范的要求，对空气消毒的臭氧浓度是5ppm ，但事实上，洁净区的消毒不仅是对空气的消毒，实际上还包括了物体表面的消毒，所以，我们的设计浓度为 10 ppm 。每天上班前开机二小时，上班时关机，就可以保证一天内洁净区的浮游菌和沉降菌达到GMP 的要求。

3．密闭空间的消毒

对于中央空调净化系统以外的洁净室，或需要消毒的其他房间则需要单独进行消毒处理。方法是选用移动式臭氧发生器（HA-B 型），直接安装在该房间内。根据需要设定消毒时间，消毒结束便自动关机，所以使用非常方便。

对于有洁净度要求的房间，机内装有过滤器，使臭氧发生器具有自洁净功能。臭氧浓度按10-20 ppm 设计。按房间空间体积的大小选型使用。只要满足臭氧浓度的要求，就可以达到消毒的目的。比用化学试剂对房间的熏蒸要省事得多。

4．物品的表面消毒

在药品生产的过程中，常常要对原材料，工器具，包装物等进行表面消毒，常常使用消毒柜，传递窗等。传统的方法是用紫外线消毒。问题主要是在于消毒不彻底，所以，若使用在诸如传递窗等要求不高的场合是可以的。但远不如臭氧的效果好。用臭氧发生器做成的消毒柜（HB 型）在制药厂是深受欢迎的。只要不怕臭氧腐蚀的东西都可以放在柜内进行消毒。臭氧浓度可以设计得高一点，取到100 ppm 以上，只要十几分钟就可以达到设计要求。

5．药厂用水的消毒

在制药厂用水的地方较多，有医药用水，消毒用水，清洗用水及饮用水等区别。根据不同的水质要求，采用不同的工艺流程，消毒工艺则用一般的臭氧水处理方法即可达到满意的效果。这里就不再详细介绍了。

需要特别注意的是医用注射液用水，则要求不能存在热源。热源是细菌病毒死亡之后留下来的内毒素。臭氧能不能消除热源，有待进行研究确定。如果确定臭氧可以除去水中的热源，那么，臭氧在药品生产中的应用又可以开辟一条新的途径。

以上，仅从几个方面介绍了臭氧在药品生产中的应用实例，可以看出在药品生产中臭氧是大有作为的。GMP 验证为臭氧技术的应用提供了广阔的机遇。我们一定要抓住这个机遇，在新的研究课题上有所突破，臭氧工作者的责任是制造出性能稳定可靠的精品臭氧发生器，为药品生产服务，造福人类，那么我们为大众的健康又做了更加有益的工作。

四、臭氧在制药行业中应用标准及验证方法

1． 臭氧在制药行业中应用的浓度标准

臭氧对空气中的微生物的灭活浓度和对物体表面沉降的微生物的灭活浓度。根据卫生部1991年12月颁布的《消毒技术规范》第4.12臭氧应用章节中第8.2款空气消毒中规定“对密闭的空气用5～10mg/m3浓度（相当于2.5～5ppm ）的臭氧作用30分钟；对物体表面的沉降菌落需要20～30mg/m3，（相当于10～15ppm ）”。制药行业应用臭氧的目的是用来替代紫外线和化学薰蒸。对整个洁净区空气及机械设备、介质材料表

面的沉降菌落进行大消毒。确定的臭氧浓度为10～15ppm ，相当于每立方空气中臭氧含量20～30mg 。

2．臭氧应用量的计算方法

设：V1为洁净区空间体积，V2为HVAC 系统空间体积，V3为保持洁净区正压所补充的新风对臭氧造成的损失。

则灭菌空间的总体积（V ）计算为： V=V1+V2+V3

V3的确定：根据若干使用臭氧发生器消毒灭菌的厂家实践，归纳出较为可靠的经验公式如下：V3≈HVAC系统循环总风量m3/h×25%（常规新风更换率）×10-20%（保持洁净区正压补充的新风量）×39%（计算应用臭氧时臭氧半衰期的预算值），即V3=HVAC 系统循环总风量×1～2%。

V2的确定：根据若干使用臭氧发生器消毒灭菌的厂家实践，归纳出较为可靠的经验公式如下：V2≈洁净区空间体积（V1）×20-25%

臭氧发生器的选择：先按臭氧灭菌的效率，即参照《消毒技术规范》的标准确定臭氧灭菌的浓度（C ）：对空气中浮游菌，臭氧灭菌浓度为2.5～5ppm ；对物体表面的沉降菌落，浓度为10～15ppm （臭氧灭菌浓度参考卫生部1991年12月《消毒技术规范》）。臭氧的自然半衰期（S ），参比状态下为23min 左右，一个小时的衰退率约为61%；设计：应用臭氧灭菌60min 时达到要求浓度后，继续保持一段时间（1～1.5小时），即可得到机械设备和建筑物体表面沉降菌落彻底杀灭的作用，达到化学薰蒸大消毒的效果。

例：灭菌空间总体积(V)为1000m3，灭菌要求为替代化学薰蒸大消毒，对设备和建筑物体表面沉降菌落进行灭菌。按照上述要求空气中臭氧浓度(C)应达到10ppm 以上（在工作状态下，折算为19.63mg/m3），臭氧发生器工作一个小时后臭氧自然衰退率(S)为61%，需选择机器臭氧发生量g/h(W)：

W = C V / (1-S) = 19.63 × 1000 / (1-61%) ≈ 50.33(g/h)

这样的气流需臭氧发生量为50.33g/h，可选择每小时产量为50g 的臭氧发生器。

3． 臭氧浓度的测试方法

对空气中臭氧浓度的测试，目前我国使用最普遍的有碘量法和紫外线吸收法两种。 ·碘量法在我国建设部发布的《臭氧发生器臭氧浓度、产量、电耗的测量》一文中，作为行业标准文件，已详细介绍了测试方法。该方法最大特点是无需配套贵重仪器设备，操作方便，但易受其它氧化剂的影响而降低测试精度。

·紫外吸收法是国内外广泛使用的一种方法，美国环保局就是以紫外吸收法来测试较高浓度的臭氧，作为大气测定的标准方法。它是利用臭氧对波长为245nm 紫外光的吸收，再以光度计来测量动态流动系统中的臭氧浓度。仪器内设置微动泵，使用时只需将φ6mm的采样管插入被测容器，使仪器吸入样气，即可显示出臭氧浓度（ppm 或m g/m3）。操作方便，精度高，重复性能稳定，但仪器售价较高。

4．我们做臭氧灭菌模拟报告的目的

根据用户提供的数据配制臭氧发生器，做出臭氧灭菌验证的模拟报告，用户按模拟报告的条款进行逐项验证，记录于报告中，检验我们的模拟报告数据是否符合用户验证报告。

我们做臭氧灭菌模拟报告的目的:

1、让用户在编制GMP 认证文件时有个参考；

2. 、以验证报告中的数据衡量我们设计臭氧的用量和臭氧发生器设备的质量以及臭氧的灭菌效果；

3、作为设备档案存档, 便于更好的向客户提供全方位的优质服务。

国家标准（GB/T18883-2002）规定的室内所允许的臭氧浓度值为0.16mg/m3（0.08pp m ）, 即满足劳动保护要求。

生产中可以通入新风稀释或保留有足够的时间进行衰减，

由于臭氧是一种强氧化剂，具有强氧化性，它和很多物质都发生反应，主要包括臭氧的自然衰减，臭氧与接种室内墙壁、菌包或其它物质的反应等都可加快臭氧的分解，为加快其分解速度或进行稀释、驱逐，众多方法还有待于行业人员集思广益，方法总比问题多，没有一项东西的应用是完美的，这需要我们的改进或革新。