赖氨酸检验
一、 实际配制
1.1柠檬酸缓冲溶液(PH1.3)准确称取10.6克一水柠檬酸,4.2克NaOH溶于200mL蒸馏水中,用35%盐酸调PH至1.3再用蒸馏水定溶至250ml,放置冰箱中备用。
1.2茚三酮显色剂的配制准确称取10克茚三酮,13.4克二水氯化铜,125ml柠檬酸缓冲液,375ml乙二醇甲醚混匀,用蒸馏水定溶至1000ml,放置冰箱中备用。
1.3标准溶液的配制准确赖氨酸或赖氨酸盐酸盐标准药品(预先在100-105摄氏度恒重)1.0000克(精确至0.0002克),用蒸馏水溶解后定溶至100ml,用时分别移取2ml 3ml 4ml 5ml
20mg/dl 于100ml容量瓶中并定溶,制成
30mg/dl 40mg/dl 50mg/dl 的赖氨酸或赖氨酸盐酸盐标准溶液
仪器:电子天平(感量0.0001g)、722型分光光度计、80-2型离心机(3000转/分)、吸量管(1ml 5ml 10ml)、容量瓶(50ml 100ml 200ml 250ml 500ml 1000ml
)、离心管(10ml)、试管(18mmⅹ180mm)或25ml比色管
三、标准曲线的绘制
于三支洁净的试管中用吸管分别准确吸取1ml茚三酮溶液,再分别准确加入1ml20mg/dl 1ml30mg/dl 1ml40mg/dl 1ml50mg/dl的标准赖氨酸溶液,用盖盖好。放于100℃的水浴里加热10分钟,然后放置在冷水中冷却至室温,然后于三支试管里分别加入8ml蒸馏水,摇匀。用722分光光度计在475nm处测定吸光度值,以吸光度值为横坐标,浓度值为纵坐标做曲线,算出曲线方程:y=ax+b 要求标准曲线的回归系数应达到R=0.9999,由于在
20-50ml/di含赖氨酸于吸光度有近似直线关系,所以可用此方法测定赖氨酸的含量
五、样品的测定
在三根洁净的比色管中分别吸取1ml的茚三酮,再分别加入1ml的标准样、1ml蒸馏水、1ml离心后上清液,用盖盖好,于100℃的水浴里加热10分钟。然后放置在冷水中至室温。再分别吸取8ml的蒸馏水,摇匀。用分光光度计在475nm波长下测定吸光度值。
计算公式:
Lys=Nⅹnⅹ稀释倍数/1000
N-------样品的吸光度值代入曲线方程后的数值
F-------标准样的吸光度值代入曲线方程的数值
n-------F与标准样的的实际值的比值即校正系数
六、允许差:两次测定结果的差值在正负1%