(附件三)优秀青年项目申报表模板

项 目 类 别重点 √ 所属学科： 中医学优 秀 青 年 一 般湖南省教育厅科学研究项目申请书项 目 名称：基于 TLR-NK-kB 信号通路探讨大承气汤对肠源性 脓毒症模型鼠干预作用的分子机制申请者： 孙必强 校： 湖南中医药高等专科学校 话： [1**********] 真： [email protected]所 在 学 电 传电子信箱 (Email): 申 请 日期： 2013 年 3 月 29湖南省教育厅 2013 年制填 报 说 明一、申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨。外来语 要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。除签名外，项目申请 书必须是打印件。 二、申请书一律用 A4 纸，于左侧装订成册。第二页起各栏空格不够时，请自行加 页。如有查新报告及其它附件材料，请连同申请书一起装订成册。附件不超过 20 页。 三、 “所属学科”按湖南高校科技网政策法规栏公布的二级学科名称填写， “项目 类别”在“重点” 、 “优秀青年” 、 “一般”三类中选择。（封 2，此页不装订）一、简表项目名称 研究类型 研究年限 姓名 基于 TLR-NK-kB 信号通路探讨大承气汤对肠源性脓毒症模型鼠干预作用的分子机制 基础研究（√） 2014 年 至 2016 孙必强 年 学位 3年 硕士 应用研究（ ） 申请经费（万元） 职称 讲师 身份证号码 4.0 万 [***********] 试验发展（ ）项 目 负 责 人主要学习和工作经历(自大学开始) 1998～2001 大同医学专科学校 2001～2003 山西中医学院 2004～2007 湖南中医药大学 2007～至今 湖南中医药高等专科学校 2013～至今 湖南中医药大学中西医结合专业学习 中西医结合专业学习 中药学专业学习 教学 中西医结合临床专业在职博士学习联合申请单位 姓 名 职 称 已获 学位 专业 本人 签名 所在单位 身份号码其 它 主 要 研 究 人 员1二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析） 1． 脓毒症（sepsis）是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，导致机体对感染产生剧烈的全身性炎 症反应综合征(systematic inflammatory response syndrome，SIRS)。本症是感染、休克、创伤、烧伤等临床危重患 者常见严重并发症之一，其一旦演变为脓毒性休克（septic shock，SS） 、多器官功能障碍综合征(multiple organ olysfunction syndrome，MODS)或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS） ，则治疗困难、 预后极差，易致患者死亡【1-5】 。尽管人类已经进入分子医学时代，但脓毒症发病率及死亡率居高不下。以美国 为例， 1979 年发病率为 8217/10 万， 2000 年已升至 24014/10 万,病死率 28.6% 【6】 在 2003 年， 对德国 310 家 ICU 的研究表明，脓毒症和严重脓毒症的发病率分别为 12%和 13%【7】 。国内在 2002~2005 年的一项对 11 省市 37 家医院 1087 例重症患者的前瞻性、多中心研究显示，脓毒症发病率为 77.6%，脓毒性休克发生率为 38.9%，两 者的病死率分别为 63.3%和 71.4%【8】 。在脓毒症的治疗中， 【除常见的创(烧)伤创面、吸入性损伤及医源性污染 等外源性感染外，约 1／3 的患者体内始终找不到原发感染灶，虽经各种抗生素治疗终究未能控制脓毒症而发生 MODS，进一步观察到这类患者及动物模型体内常表现明显的肠道细菌移位现象，诱发和／或造成严重创伤、休 克、感染后“二次打击的发生、发展【9】 。因此研究人员推测胃肠道是这类脓毒症患者的细菌感染源。 20 世纪 60 年代， Ravin 等提出胃肠道是发生多器官功能衰竭前无明确感染灶的病人发生脓毒症的潜在致病源。 1986 年 Meakins 等提出“胃肠道是 MODS 的始动器官”的著名论点【10】 。1987 年 Border 等进一步提出肠源性脓 毒症(gut origin sepsis，GOS)的概念。目前已有研究表明：胃肠道可能是促发 SIRS 失控的重要病理环节，其在 SIRS、脓毒症、MODS 的连续发生发展中起重要作用。肠道是人体最大的细菌及内毒素贮存库。生理情况下， 依赖于宿主完整的胃肠黏膜屏障、 胃肠道菌群的微生态平衡及健全的免疫防御系统， 肠腔内细菌及其主要产物(内 毒素)并不危害机体健康。但病理情况下,在多种应激因素作用下，机体胃肠黏膜屏障功能受损、胃肠道菌群微生 态学异常、 宿主免疫功能抑制或全身防御系统受到严重破坏， 细菌及内毒素通过受损肠黏膜屏障迁移到肠系膜淋 巴组织、淋巴液、血液和肠外组织器官，从而诱发肠道细菌移位或内毒素血症，进一步发展可引起肠源性脓毒症 (gut origin sepsis,GOS), 甚至诱发脓毒症休克（ septic shock ， SS ）和多器官功能衰竭 MODS(multiple organ olysfunction syndrome，MODS)。虽然当前医疗条件不断改善,但肠源性脓毒症的病死率一直居高不下，并成为外 科危重症患者的主要死亡原因之一，故胃肠道因素在脓毒症发生、发展中的作用不容忽视。 2． 肠源性脓毒症与 TLR-NF-kB 通路 脓毒症的发生，Wenzel 等【11】认为是机体在 SIRS 基础上合并感染的过 程,Beal 等【12】也认为是感染等因素逐步引起的 SIRS。不管怎样,它总是包括 SIRS 及感染两个基本过程,两者相 互影响,促进脓毒症的发生。 GOS 作为一种特殊的脓毒症,其发生过程也是如此,仅其感染方式较为特殊， 即肠道细 菌移位，故其与机体参与炎症通路有密切关系。 核转录因子（NF-kB）是一种广泛存在于真核细胞内的基因多向性转录因子，属 Rel 家族，于 1986 年首次在小鼠 B 淋巴细胞的核抽提物中发现，因能与免疫球蛋白 k 链基因的增强子 kB 序列（GGGACTTTCC）特异性结 合而命名。NF- kB 信号转导通路是肠源性脓毒症重要的下游通路。与有活性的 DNA 结合的经典 NF- kB 信号是 一个二聚体（p50 和 p65 的二聚体） ，静息状态下，NF-kB 以无活性的潜在状态存在于细胞浆中，它与一种抑制 因子 IkB 结合组成一个三聚体 p50-p65-IkB。当细胞受到 TNF-α 、IL-1 等炎性因子刺激时，IkB 即从三聚体中解 离出来，暴露出 p50 亚基上的易位信号和 p65 亚基上的 DNA 结合位点，从而使此异二聚物表现出 NF-kB 活性， 并从胞浆中进入到细胞核中，与 kB 基序（kB motif)相结合，从而发挥转录调控作用。因此 NF-κ B 在调节免疫 应答、炎症反应、细胞增殖、分化及凋亡等方面起关键作用【13】 。 Toll 样受体 ( Toll-like receptors，TLRs )家族是 I 型跨膜蛋白受体，具有信号传导功能，是先天免疫系统中跨膜 受体和模式识别受体之一， 其诱导和调控的细胞因子和炎性递质在 GOS 中占有重要的地位。 在炎症反应过程中， TLR2 和 TLR4 的研究比较透彻。TLR2 具有广泛的识别能力，TLR4 对 LPS 的信号非常重要。TLRs 一旦与体内 特异性配体结合后，通过 MyD88 依赖的信号通路或通过 MyD88 非依赖的信号通路激活 Ik B 激酶（IKK） ，从而 激活 NF-κ B，诱导一系列炎症细胞因子的表达，如 TNF-α 、IL-β 、IL-2、 IL-6 、IL-8 等。 当机体处在脓毒症的进程中，会释放大量的 TNF-α ，TNF-α 与 TLRs 结合【14】后，TLR 激活肿瘤坏死因子受 体相关因子 6（TRAF6） 【15】 ，,TRAF6 被磷酸纤维素化后，可降解 NF-kB 抑制蛋白（Ik B） 【16】 ，Ik B 的降解 使 NF-kB 的静息状态得以解除， NF-kB 转入细胞核中诱导特定基因的表达。 NF-kB 活化后可以增强 TNF-α 、 IL-1 等细胞因子的转录基因【17 18】使其产生和释放增多，其正反馈反应使得 NF-kB 继续增多，出现炎症介质的“瀑2布样级联”反应的作用，又使炎症介质 IL-6 产生和释放增加。脓毒症发病机制非常复杂，与内外毒素的侵入， 炎症反应的强弱，免疫应答机组织损害等有密切关系，而 TLR-NF-kB 通路是炎症反应时机体产生免疫应答和炎 症反应的关键信号系统。3．大承气汤治疗肠源性脓毒症 祖国传统医学中并无肠源性脓毒症之说，据其临床特点，本病应归属于中医学伤寒、温病之范畴。其基本病 机是热毒阻弊，气滞血瘀，治宜清热解毒、通腑利气、活血化瘀。大承气汤出自《伤寒论》 ，方中大黄泻热通便， 荡涤肠胃，兼有活血化瘀之效，为君药；芒硝助大黄泻热通便，并能软坚润燥，为臣药，二药相须为用，峻下热 结之力甚强；积滞内阻，则腑气不通，故以厚朴、枳实行气散结，消痞除满，并助硝、黄推荡积滞以加速热结之 排泄，共为佐使。全方用药虽少，但其峻下热结功效显著，主治阳明腑实证、热结旁流以及里热实证之热厥、痉 病或发狂等。现代研究表明，直肠黏膜有很强的吸收能力，药物通过肠道内静脉进入大循环而发挥治疗作用。有 研究【19-23】也证明，大承气汤有抑制血清内毒素、降低炎性细胞因子、双向调节免疫、抗菌、改善肺水肿、 促进肺泡上皮增生、保护多脏器功能等作用。另相关研究表明【24-26】 ，以大承气汤为主的通里攻下法能够增加 胃肠蠕动,改善胃肠功能,促进新陈代谢,清除肠道内细菌和毒素;活血化淤,改善微循环,解除胃肠缺血缺氧状态,降 低肠黏膜毛细血管通透性和内毒素易位 ;还可以降低炎性介质的产生和释放大承气颗粒不仅可抑制 SS 病人以 TNF-α 为代表的促炎因子过度分泌,还可促进抗炎介质 IL-10、PGE2 的下降,促进 Th 细胞漂移和 HLA-DR 表达下 降的恢复,有利于免疫平衡的恢复【27】 。 4.提出假说： TNF-α 作为脓毒症时炎症级联反应启动过程中的早期炎症介质，是炎症发生时的上游信号，上述相关研究表明 大承气汤能降低其表达水平。而 TLR-NF-kB 通路是一条经典炎症反应信号通路，基于临床中大承气汤对肠源性 脓毒症治疗有效，推测其应对 TLRs 或（和）NF-kB 的表达也应有一定的抑制作用，从而影响 TLR-NF-kB 信号 通路。 参考文献： 1.姚咏明 ，柴家科 ，盛志勇．烧伤脓毒症的诊断标准与防治．中华烧伤杂志 ，2003，19(2)：65-66． 2.Liboni KC，Li N，Scumpia PO，et a1．Glutamine modulates LPS-induced IL-8 production through IKB／NF-KB in human fetal and adult intestinal epithelium[J]．J Nutr，2005，135(2)：245-251． 3.强新华，康焰．.脓毒血症和感染性休克的治疗现状[J]．华西医学杂志，2005,20（4） ：791-792． 4.Dellinger RP，Levy MM，Carlet JM，et al．Surviving Sepsis Campaign:intenational guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2008[J]．Crit Care Med ,2008,36(1):296-327．35.ZambonM，Ceola M，Almedia-de-Castro R，et 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TLR2、TLR4、NF-Kb/P65mRNA四、可行性分析 (1)项目申请者有多年从事中医临床工作和复方药理学研究工作经验，主持完成 1 项省级课题，参加过 4 项省市级科研项目。 (2)目前申请者在湖南中医药大学攻读中西医结合临床专业学习， 相关的学习背景也能为课题的保质保量完 成提供支持。 (3) 课题组成人员由中、高级职称为主，结构合理，且都具备多年科研工作经验，能确保实验研究顺利进 行。 （4）动物模型制备和给药方法已经过预示和准备，具备了较好的前期工作基础。6五、本项目的创新之处 本项目的创新之处在于： 1）结合马钱子胶的中药药理学基础和临床治疗宫颈炎的效果，提出通过实验研究其治疗作用机理。 2）借鉴 EGF 在治疗宫颈炎效果中的重要标示，通过实验研究马钱子胶干预后的宫颈粘膜组织 EGF 的表达 情况。 3）为以后临床推广应用提供中药依据，促进成药开发新的治疗领域。六 预期研究进展 本实验拟分为四个阶段进行 （1）2014.7----2014.12 文献查阅，进行预实验 （2）2015.1----2015.9 动物造模，给药，指标检测（3）2015.10-----2016.1 继续实验，数据统计，完成论文 （4）2016.3-----2016.7 整理资料，准备结题七．预期成果 本课题研究可为临床工作提供基础研究支持及指导，结果以论文形式发表，在国家级刊物上发表高质量的 研究论文 2-3 篇。7四、研究基础与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩及目前承担项目的情况（项目负责人和其它成员情况分 开填写并且项目、成果及奖励等须注明承担或完成人姓名等相关信息）主持人在临床曾与妇科医师进行了多年的合作，有一定的临床验证。同时也参阅了多家临床报道，说明该方 治疗宫颈炎确有疗效。主持并完成一项教学课题，现已结题。目前没主持在研课题。 本课题组组成人员多为高中级职称人员，有妇科主任、方剂学等基础课程老师及临床医师。人员组成及结构合 理，能胜任本课题的研究工作。89五、经费预算支 出 科 目 金 额 （万元） 2.0 计 算 根 据 及 理 由1. 合计0.1 文献查新费 实验材料费和指标检 测费 开题和结题费用 1.0立项查新、成果查新购买实验动物、实验试剂、试剂盒及相关检测费0.1 开题论文和结题论文资料打印费0.2 结题材料、评奖材料印制成果鉴定费0.2 课题终结专家鉴定学术交流费0.2 参加学术会议论文发表版面费0.1 论文发表其他0.1 水电费及动物饲料等注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 科学研究项目管理办法》 （2010 年第 2 次修订） 。2. 实验材料费3. 仪器设备费 4.相关经费。开支范围详见《湖南省教育厅10学校 科研 管理 部门 审查 以及 经费 配套 意见 负责人： （公章） 年 月 日合作 单位 意见 （公章） 负责人： 年 月 日省教 育厅 审定 意见负责人：年月日11