分子生物学实验复习题附答案

分子生物学复习题

实验一 DNA 的制备

（1）为什么分子生物学实施时要担心EB ？

溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA 诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌)

（2）DNA 加样缓冲液的用途是什么？

由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类) 对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇) 以降低这些酶类的活性。

（3）DNA 电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？

1．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

（2）琼脂脂糖的浓度 不同大小的DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度与DNA 分离范围

琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线状DNA 大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1

（4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA 的原理是什么 DNA 分子在pH 值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA 分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA 分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA 分离。DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA 分子大小超过20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA 时，分子大小不宜超过此值。

（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA 是靠什么发出荧光的？为什么？

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂, 可插入DNA 双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm 波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA ，可检出10-9g 以上的DNA 含量。

（6）制备基因组DNA 时用到的以下试剂分别起什么作用？

CTAB 等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA 得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。 75%乙醇, 乙醇轻轻洗涤管壁

实验二 RNA 的制备

1. 制备RNA 时通常要注意些什么？为什么？

应该要注意(1)不要徒手操作, 必须带手套;(2)加样时不能够大声说话, 防止唾液等进入;

由于RNA 分子的结构特点，容易受RNA 酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。

2. 制备的RNA 通常有哪些用途？制备的DNA 通常又有哪些用途？

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA 。

质粒DNA 构建克隆载体, 分离目的基因

3.RNA 制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA 质量好坏？为什么？

1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA 样品应呈现三条带：28S 、18S 、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18SrRNA 条带的1.5~2倍。反之，说明部分28S rRNA已经降解成18S rRNA 。若无清晰条带，则说明样品RNA 已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA 污染。

4.RNA 制备好后通过什么方法测定其含量？

RNA 通常用分光光度计测量，通常在A260的读书在0.15-1.0之间才是可靠的，A260为1相当于RNA 的浓度为40微克/ml

实验三 质粒DNA 的制备

1. 什么是质粒？质粒有什么主要用途？

染色体外小型（1-200kb ）的共价、闭合、环状的双链DNA 分子（cccDNA ），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等

用途:把一个有用的目的DNA 片段通过重组DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

2. 分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

1环状DNA 分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。

2有多个限制酶切点(便于切割)

3有标记基因(便于进行检验)

3. 制备的质粒DNA 在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？哪种条带形式的质粒DNA 其转化或转染效率最高？

三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。

实验四 感受态细菌的制备及质粒DNA 的转化

（1）什么是感受态细菌？感受态细菌的主要用途是什么？

感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 感受态细菌吸收异源 DNA 分子，使受体细胞获得新的遗传性状.

（2）什么是转化？转化与转染的主要区别是什么？

转化（transformation) 感受态细菌捕获质粒DNA 的过程

转染（transfection) 细菌捕获噬菌体DNA 的过程

（3）有哪些主要因素决定质粒DNA 的转化效率？

1. 细菌的生长状态和密度：OD006=0.3~0.5 细菌出于对数期或者对数前期

2. 质粒DNA ：

数量：质粒DNA 不超过感受态细胞体积的5%

大小：分子量越大转化效率越低，超过30Kb 的质粒DNA 很难转化成功

构型：超螺旋的DNA 具有较高的转化效率，重组DNA 效率低一些，环状DNA 相比线性DNA 转化效率高一些

3. 所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度

4. 防止杂菌和其他外源DNA 的污染

（4）质粒DNA 的转化过程可分为哪几个阶段？每个阶段中主要发生了什么事件？

1吸附阶段：完整的双链DNA 分子吸附于感受态细胞表面。

2转入阶段：双链DNA 分子解链，以单链形式进入细胞，而另一链则被降解。

3自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA

4表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被转录及翻译。

（5）什么是转化子？什么是非转化子？

转化子：带有异源 DNA 分子的受体细胞

非转化子:不带有异源 DNA(质粒) 分子的受体细胞

实验五 质粒DNA 的酶切与鉴定

（1）限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？

是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA 的核酸内切酶。限制性内切酶天然存在于细菌体内

（2）什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？

限制性内切酶, 与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-Modification System）。 用途:降解外来DNA 分子，以限制（restriction ）或阻止病毒侵染，是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。

（3）限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？

Ⅰ型限制性内切酶功能：限制、修饰

特点：需 Mg2+、ATP 和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）

应用：不常用。

Ⅱ型限制性内切酶功能：功能：识别并特异切割DNA 分子, 即通常所指的DNA 限制性核酸内切酶。 特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA 的特殊序列，并可特异切割DNA ，产生特异性的片段。

应用：种类繁多, 分子克隆最常用的内切酶。

Ⅲ型限制性内切酶限制、修饰

特点：需Mg2+、ATP 和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp 处

应用：数量很少，分子克隆中无实际作用

（4）限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？

II 型限制性核酸内切酶的识别序列通常是对称的，识别位点序列长度为4-8个核苷酸对。这种对称序列称为回纹序列（palindrome ）。

（5）酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？

限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。

限制性内切酶溶液通常含有50%甘油

（6）1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？

酶活力单位的量度。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1min 内能转化1μmol底物的酶量，或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。

实验六 目的基因的PCR 扩增

（1）PCR 反应液中主要成分是哪些？在PCR 反应过程中各起什么作用？

DNA 模板、反应缓冲液、dNTP 、MgCl2、两条合成的DNA 引物、耐热DNA Taq聚合酶。

（2）为什么在PCR 反应过程中，使用三个不同的温度变化？

高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

1、变性：加热使模板DNA 在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA ，即退火阶段。

3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP ），按5’到3’方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。

（3）用PCR 扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

由于PCR 灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA 的污染。

1. 所有与PCR 有关的试剂，只作PCR 实验用，而不挪作它用。

2. 操作中所用的PCR 管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。

3. 每加一种反应物，应换新的枪头。

实验七 DNA 重组及转化实验

（1）什么是T-载体？

聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR 产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T 载体之间的A-T 互补性可提高PCR 产物克隆的效率。

（2）什么是T-A 克隆？

TA 克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR 片断与一个具有3‘-T 突出的载体DNA 连接起来的方法。

（3）T-A 克隆DNA 重组实验的主要步骤有哪些？

切, 接, 转, 增, 检

（4）目前获取目的基因的常用方法有哪些？

一直接获取目的基因：

1、从供体细胞直接获取 （鸟枪法--用限制性内切酶处理DNA ）

2、从基因组文库中获取

二合成法获取目的基因：

1、利用mRNA 反转录形成

2、人工合成即根据蛋白质的氨基酸的序列推导出mRNA 的核糖核苷酸序列，再推导出DNA 的脱氧核苷酸的序列，最后用化学合成法合成目的基因

3、PCR 扩增

（5）蓝-白斑筛选的原理是什么？

n 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) 存在下被IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷) 诱导形成蓝色菌落。

n 当外源片段插入到pUCm-T 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变， 表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。此为α-互补现象筛选。