实验七醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白
实验七 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白
一.目的
掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。
二、原理
蛋白质是两性电解质。当PH>PI时,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动;当PH
本试验以牛血清为材料,醋酸纤维薄膜为支持物,通过点样、电泳、 血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱,再进行观察和定量分析。 于pH7.0,在缓冲液中(pH8.6)中,电离成负离子,在电场中向阳极移动。用醋酸纤维薄膜作蛋白电泳有简便,快速,分离清晰,容易定量等优点。
三、实验仪器
1、牛血清 2 、醋酸纤维薄膜 3 、镊子 4 、电泳仪 5 、电泳槽 6 、 盖玻片
四、实验试剂
1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液(离子强度,PH8.6):称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g,溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。
2、 染色液:氨基黑10B0.5g,甲醇50ml,冰乙酸10ml,蒸馏水40ml混匀即可。
3、 漂洗液:95%乙醇45ml,冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。
五、实验步骤
1、准备:用镊子取薄膜一条,浸入缓冲液中,完全浸透后(大约3-5分钟),用镊子取出,将无光泽的一面向上,平放在干净滤纸上,将滤纸对折,吸取多余的缓冲液(注意不要吸的太干)。
2、点样:取盖玻片一块,用玻璃棒将血清均匀的涂在盖玻片的一端面上,直直的在薄膜一端1/3处点样。
3、电泳:将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上,无光泽面要向下放置,点样端放在阴极,进行电泳。电泳条件:电压90-110V,电流0.4-0.6A,通电60分钟。
4、 染色:电泳完毕,将薄膜浸入染色液(回收)中10分钟,进行染色。
5、漂洗:染色完毕,将薄膜取出,放入漂洗液中漂洗至背景无色,在浸入蒸馏水中。
6、图谱观察:观察图谱,将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。
注意事项
请带试验的老师试验结束后,将镊子回收。
醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面。
电泳槽中间为正极,两端为负极。
染色液请用完后回收到原来的试剂瓶中。
漂洗薄膜时,请做到“少量多漂”,即用少量的漂洗液去漂洗薄膜,多漂几次,这样既不浪费漂洗液,还达到了漂洗的效果。
六.实验结果
七.实验分析
醋酸纤维素薄膜电泳特点:
1.(1)醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后背景能完全脱色,各种蛋白质染色带分离清晰,因而提高了测定的精确性。
(2)快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小,薄膜中所容纳的缓冲液也较少,电渗作用小,电泳时大部分电流是由样品传导的,所以分离速度快,电泳时间短,一般电泳45—60min即可,加上染色,脱色,整个电泳完成仅需90min左右。
(3)灵敏度高,样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清,甚至加样体积少至0.1μl,仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点,检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
(4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离,如胎儿甲种球蛋白,溶菌酶,胰岛素,组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
(5)醋酸纤维素薄膜电泳染色后,经冰乙酸,乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于扫描定量及长期保存。
2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,操作简单,但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中,只能分离出5—6条区带,而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。
根据样品理化性质,从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类,pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强,对显色或紫外光等观察区带没有影响,若样品含盐量较高时,宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液;氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号,点上样品,在一定的
电压,电流下电泳一定时间,取下滤膜,进行染色。不同物质需采用不同的显色方法,如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位,但许多物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下,溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用光密度计测定。
它的缺点是厚度小,样品用量很小,不适于制备。
[注意事项]
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面,其目的是选择膜片厚薄及均匀度,如漂浮15s—30s时,膜片吸水不均匀,则有白斑点或条纹,这提示膜片厚薄不匀,应舍去不用,以免造成电泳后区带扭曲,界线不清,背景脱色困难,结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小,浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液,并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉,这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时,应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染,取膜时,应戴指套或用镊子。
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液,其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时,先初步定下某一浓度,如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm,则需电压25V/cm膜长,电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电
泳达不到或超过这个值时,则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽;缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨。
3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则,检测方法越灵敏,加样量则越少,对分离更有利。如加样量过大,则电泳后区带分离不清楚,甚至互相干扰,染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时,每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时,每厘米加样线加样量不超过1μl,相当于60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时,加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一,以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度,一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增加,造成膜片干涸。电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散。
5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力,背景易脱色;应尽量采用水溶性染料,不宜选择醇溶性染料,以免引起醋酸纤维素膜溶解。
应控制染色时间。时间长,薄膜底色深不易脱去;时间短,着色浅不宜区分,或造成条带染色不均,必要时可进行复染。
6、透明及保存
透明液应临用前配制,以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前,薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好,如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解,太短则透明度不佳。
透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中,使薄膜软化。如有水,则液体石蜡不易浸入,薄膜不易平展。