1木聚糖酶活性测定的实践与研究

分析与检测

中国酿造

2009年第11期总第212期··149

木聚糖酶活性测定的实践与研究

郝涤非

（江苏食品职业技术学院食品工程系，江苏淮安223003）

摘

要：研究了木聚糖酶活性测定中的几个关键因素对酶活测定值的影响，并以此为主要依据，建立了应用DNS 法测定木聚糖酶活力的方法：在50℃、pH6.50条件下，底物浓度1%，酶促反应时间10min ，DNS 显色5min ，于波长540nm 处测定吸光度值。以期建立木聚糖

酶活性检测的最佳条件，为进一步研究木聚糖酶纯化工艺提供相关的参考依据。关键词：木聚糖酶；活性测定；DNS 法中图分类号：O657.32

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2009）11-0149-04

Determination of xylanase activity

HAO Difei

(Departmentof Food Engineering, Jiiangsu Institute of Food Science, Huaian 223003, China)

Abstract:The effects of several key factors on determination of xylanase activity were investigated in this paper. The method of DNS to determine the activity of xylanase was further estabilsihed. The determination conditions were obtained as followed:temperatuere 50℃, pH 6.50, substrate concen-tration 1%,reaction time 10min, colour development of DNS 5min and wavelength 540nm. Key words:xylanase; activity determination; DNS method

1绪论

1.1木聚糖酶概述

木聚糖酶（Xylanase ）是指能专一降解半纤维素木聚糖①β-1，为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。主要包括3类：4-D-内切木聚糖酶（EC3.2.1.8），从木聚糖主链的内部切割β-1，4糖苷键, 使木聚糖溶液的黏度迅速降低；②β-1，4-D-外切木聚糖酶(EC3.2.1.92），以单个木糖为切割单位作用于木聚糖的非还原性末端，使反应体系的还原性不断增加；③β-木糖苷酶（EC3.2.1.37），切割低聚木糖和木二糖，其水解产物主要为木糖、木二糖及木三糖等低聚木糖[1]。

目前，木聚糖酶主要来源于细菌与真菌，包括厌氧菌、需氧菌、嗜温微生物、嗜热微生物和极端微生物等。根据酶的理化特性，可分为2大类：即分子量小于30ku 的碱性木聚糖酶和分子量大于30ku 的酸性木聚糖酶。通常细菌可以同时产生酸、碱性木聚糖酶，但真菌通常只产生低分子量的碱性木聚糖酶。从本质上讲，木聚糖酶都具有外切酶和内切酶活性，只是活性高低不同而已。不同来源的木聚外切酶活性的比例上存在很大的差异，由真菌糖酶在内、

发酵产生的木聚糖酶以外切活性为主，而以细菌发酵生产的木聚糖酶则以内切活性为主。1.2木聚糖酶的主要作用

木聚糖酶主要应用于食品工业、饲料工业中、造纸工业等行业。

1.2.1在酿酒工业中及食品工业中的应用

木聚糖酶一方面作用于谷物细胞壁中的木聚糖，加

收稿日期：2009-07-02

基金项目：淮安市科技计划项目（HAG07016）

快淀粉酶的作用，提高发酵效率，增加乙醇的产率；另一方面可降低发酵液的黏度，避免过滤时滤膜堵塞，改良啤酒口感，提高清澈度。

目前，木聚糖酶在食品行业中引人注目的应用是作为面包改良剂。在面包烘烤中，木聚糖酶可改善面团的稳定性和对过度发酵的耐受性，提高入炉急胀性能，增大烘烤当木聚糖酶添加后面包体积[2]。据张勤良等[3]的研究表明，

量为0.3mL/kg（面粉）时，面团的形成时间减少50%左右，面粉中适当地添加木聚糖酶可明显增加面包的体积和比容，改善包心的弹性、硬度及柔软性。1.2.2在饲料工业中的应用

木聚糖酶能有效地解除木聚糖的抗营养，并会把聚合度较高的木聚糖降解为聚合度较低的小分子片段，破坏细胞壁的结构，将细胞壁束缚的营养物质释放出来，使其与动物消化道内的消化酶充分接触，从而提高小麦、大麦、黑麦、燕麦等麦类饲料中养分的消化率。降解原料的细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的黏度，促进有效物质的释放以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而更易吸收可溶性脂类成分[4]。1.2.3在造纸工业方面的应用

木聚糖酶可作为生物漂白剂替代传统的化学漂白，从而大量降低氯的用量，有效降低造纸废水中大量含氯的强烈致癌致畸的物质，减轻造纸对环境的污染，为此木聚糖“制浆酶”已广泛应用于西方发达国家，产生了良好酶作为

的经济和社会效益[5]。

），男，副教授，研究方向为食品生物技术。作者简介：郝涤非（1962-

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Analysis and Examination

木聚糖酶在应用过程中，与其他酶的特性一样，其浓度（添加量）过大过小都不会达到预期的效果。而适宜浓度（添加量）与活性大小有关，因而测定酶的活性在生产实践中十分有意义。

1.3木聚糖酶活性的测定方法

酶活力测定方法大致可分为2大类，即取样法和连续法。取样法是在最适条件下，酶反应开始后一定时间内，从反应体系中取出一定量的反应液，并终止反应，然后用选定的方法分析取样液中底物消耗量或产物生成量，由此计算出酶活力。具体的分析方法有化学法、光学法、电化学法等，分光光度法是应用较广又快捷方便的方法，化学法也很经济实用。目前国内许多酶制剂生产企业大多采用这2类方法测定酶活。

连续法不对酶促反应进行终止，而是在反应过程中用特定的检测仪器，对反应底物的消失或产物的生成所伴生的某种物理量（如电位、光度等）变化进行跟踪、自动记录，并输出反应速度数据，由计算机控制。目前一般实验室缺少此类设备。目测手计也可以，但准确性差。1.3.1木聚糖酶活力单位定义

pH6.50条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的燕在50℃、

麦木聚糖溶液中降解释放1μmoL 还原糖所需的酶量为一），还原糖以木糖等量。个活力单位（IU

比活力指每毫克（mg ）酶蛋白所具有的酶活力。一般（IU/mg ）来表示。它是酶学研究用活力单位/毫克蛋白质

及生产中常用数据，可用来比较每单位质量酶蛋白的催化能力。对于同一种酶来讲，比活力越高，表明酶越纯。在实）来表示。验与生产实践中比活力也常用（IU/mL或IU/g1.3.2测定方法的原理

测定方法为取样法中的分光光度法。由于应用了DNS 试剂又称DNS 法。在一定温度和pH 值条件下，木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和具有还原性基团的单糖与DNS 试剂发生显色反应。反应液的颜色强度与酶解产生还原糖的量成正比，还原糖生成量与反应液中木聚糖酶活力成正比，通过分光比色测定反应液吸光度值，可计算木聚糖酶活力。2实验仪器与试剂2.1仪器

DK-8B 电热恒温水浴箱：上海中庸检验设备有限公司；PHS-25数显酸度计：上海雷磁仪器厂；721可见分光光度计：沈阳凯莱仪器销售有限公司；FA1204电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；德国Eppendorf （微量可调移液器）、4-α芬兰DRAGON （手动可调移液器）：北京金泰科苑科技有限公司经销；微量进样器：上海佳安分析仪器厂；CASIO 秒表：苏州CASIO 有限公司。2.2试剂

0.5mol/L的磷酸二氢钠溶液，0.5mol/L的磷酸氢二钠0.5mol/L的磷酸盐缓冲液，200g/L氢氧化钠溶液，溶液，

0.05mol/L的中性缓冲液，10mg/mL燕麦木聚糖（sigma X-0627），10mg/mL的标准木糖溶液，DNS （3，5-二硝基水杨酸）试剂，待测样品（木聚糖酶），北京艾克赛德生物工程有限公司生产。3测定方法与步骤3.1绘制标准曲线

取8支试管按表1加入相关试液后再加入1.5mL DNS 试剂，充分摇匀，置沸水浴中反应5min ，迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至5.0mL 。

用0#试管试液作对照，在波长540nm 处测定其他各试管试液的吸光度值，结果见表1。

表1

不同木糖含量样本的配置与吸光度值

Table 1. Configuration and absorbance values of xylose samples with

different concentration 项目缓冲液加入量/μL 木糖标准液加入量/μL

木糖含量/μg 吸光度值

0#

1#10100

2#98515150

3#98020200

4#97525250

5#97030300

6#96535350

7#96040400

100099000

0.0000.2190.3690.4830.6210.7420.8250.945

以吸光度值为纵坐标，以木糖含量为横坐标绘制成木糖标准曲线，见图1。

图1木糖的标准曲线

Figure 1. Standard curve of xylose

3.2待测酶液的制备

精密称取固体待测酶的酶粉1.0000g 溶于80mL 蒸馏水中（稀释倍数不大于500倍的直接用0.5mol/L的磷酸盐缓冲液溶解），室温条件下磁力搅拌10min ，补足损失的蒸馏水并定容至100mL 。离心后取上清液，用0.05mol/L的中性缓冲液稀释，控制待测酶液的浓度为0.21IU/mL~0.23IU/mL。3.3酶活的水平控制

精密称取已知酶活力的固体木聚糖酶的酶粉，按待测酶的稀释方法进行稀释，控制已知酶活的酶液浓度为0.21IU/mL~0.23IU/mL。

分析与检测

3.4酶活力的测定

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结果（图2）表明，13min 内产物的吸光度值随反应时间几乎呈线性增长，其斜率可以代表酶促反应的初速度，此后速度减慢（单位时间内产生的还原糖量呈下降趋势），相对酶活逐渐降低。由此可见，酶活力测定时反应时间以15min 为宜，时间过长或过短都不能准确反映样品的酶活力。

表2

不同测定体系的比较

（1）取3支试管各加入0.5mL 木聚糖底物，与待测酶液一起50℃恒温水浴预热5min 。

（2）在第1、第2试管中各加入0.5mL 待测酶液，在50℃恒温水浴中反应20min 。

（3）待反应完全后，在3支试管中各加入1.5mL DNS 试

剂，然后在第3支试管中补加0.5mL 的待测酶液。

（4）振荡摇匀3支试管，置于沸水浴中反应5min 。（5）迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至5.0mL 。以第3支试管试液为对照，在波长540nm 处测定第1、第2试管试液的吸光度值。吸光度值在0.25~0.35为宜，若不在此范围则需改变酶液的稀释倍数并重测其活力。

（6）待测酶液的反应液的吸光度值与水平控制酶液的反应液吸光度值之差的绝对值不得超过0.015。3.5酶活力的计算

酶活力（IU/mL或IU/g）=木糖等量值×n

式中：150为木糖从微克换算成微摩尔，μmol ；20为待测液与底物的反应时间，min ；0.5为加入反应的待测酶液量，mL ；N 为酶样的稀释倍数。

Table 2. Comparison of different measurement system 测定体系

OD 540值

10.0870.097

20.0800.0810.0900.0800.0830.0900.0980.0890.1020.0990.1230.1800.1200.1190.119

OD 540平均值均方差和

0.2mL 0.0880.0960.0920.0960.093

0.08743.6×10-4

0.4mL 0.0980.0870.0980.1260.119

0.0952.2×10-4

3.6结果允许的误差

（1）允许总分析误差范围，2次取样并且检测结果相对误差小于10%。

（2）水平控制检测酶活力与标准活力相对误差小于10%。（3）标准曲线至少由5点组成。4结果与分析

4.1木聚糖酶酶活力测定体系的误差比较

实验进行的木聚糖酶的酶活力测定体系是0.2mL 体系（0.1mL 酶液与0.1mL 底物在50℃水浴中反应5min ，最后定容至5mL ）。经过反复实验，证明此种活力测定体系在实验中最为适用，既易于实际操作，又节约试剂成本。但在大规模的产业化生产中，由于此测定体系的用量较小，因此对操作人员的技术熟练程度要求较高，所以在实际测定过程中容易带来测定的误差。对此，采用不同的测定体系对同一批木聚糖酶产品进行酶活力测定，测定体系分别是0.4mL 酶活力测定体系（0.2mL 酶液与0.2mL 底物反应最后定容至5mL ），1mL 酶活力测定体系（0.5mL 酶液与0.5mL 底物反应最后定容至5mL ）以及作为对照的0.2mL 体系。测定结果见表2。其中0.2mL 体系中粗酶液稀释了1000倍，0.4mL 和1mL 体系中粗酶液也同样稀释2000倍。

由表2可见，随着酶活力测定体系逐步变大，测得的各

1mL

0.1210.1210.125

0.12116.7×10-4

图2木聚糖酶反应曲线

Figure 2. Curve of enzyme reaction

酶催化反应的动力学表明，由于酶解产物达到一定浓度会对酶产生反馈抑制作用，因而反应速度随着时间延长会越来越慢，只有反应的初速度才与酶量成正比，因此酶活性通常是在底物大大过量的情况下测定反应初速度来求得，这是测定酶活力的一个重要通则。

酶催化反应的动力学表明，酶解是一个有一定时间差的过程，当酶解产物达到一定浓度后即会对酶产生反馈抑制作用，因而反应速度随着时间延长会越来越慢，所以酶解并非酶解时间越长越好。4.3酶液稀释度对酶活性测定的影响

由图3可知，稀释倍数为100~1000时，测得的酶活力呈

OD 540值之间的均方差变小，也就是说测得的各数值之间的

差异变小，即体系误差变小。所以，在上述3种体系中，1mL 体系测木聚糖酶酶活力误差最小，更适于在实际生产操作中运用。

4.2作用时间对酶促反应的影响

实验测定了酶促反应开始至30min 内的产物生成量，

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上升趋势。到1000倍时达到峰值，相对酶活为179.29%，稀稀释释倍数在1000倍以上时酶活呈下降趋势。由此可见，倍数对酶活测定结果影响很大。

构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。

实验的测定结果表明，随着pH 值的增大，木聚糖酶的活性逐渐升高；pH 值为6.5时，木聚糖酶的活性最高，且在pH5.5~7.5范围内木聚糖酶的活性维持较高浓度。4.5温度对酶活性测定的影响

图3酶液的稀释度对酶活的影响

Figure 3. Effects of dilution on enzyme activity

测定酶样时进行稀释可能带来2种效应，一是影响酶的稳定性；二是降低样品中原有抑制因素和辅助因素的浓度。

目前测定酶活性的方法通常是先稀释酶，然后测定稀释酶的活性，所得到的结果乘以稀释倍数即为原酶的活性。但是，许多酶的活性和稀释倍数并不成比例关系。据陆文选择酶的稀释倍数实质上是选择酶分子与底清等[6]分析，

物分子之间的数量比例，二者的比例只有在适当的范围内，酶蛋白的活性才与产物的生成量呈线性正比例关系。4.4pH 值对酶活性测定的影响

图5

木聚糖酶的最适反应温度

Figure 5. Optimal reaction temperature of xylanase

在不同的温度测定木聚糖酶的活性，结果（图5）可知，在45℃~60℃可保持在83.1%以上的酶最适反应温度为50℃，

活，当低于45℃或高于70℃时酶活性急剧下降，30℃和70℃时酶活分别为最适温度时酶活的23.15%和38.0%。

木聚糖酶对温度非常敏感，主要表现在2个方面：一方面是当温度升高时，酶与底物的反应速率加快；另一方面由于随着温度的升高将使酶的稳定性下降，部分酶蛋白分子逐渐变性而失去活性，引起酶反应速率下降。因此在检测过程中，对温度的控制显得尤为重要。

在本实验测定木聚糖酶活性时发现，50℃以下酶活较酶活性开始下降；为稳定；高于50℃后随着温度的升高，90℃时酶基本失活。同时，酶在不同条件下的适宜温度也有可能要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂以及酶促反应时间等因素的影响。

图4木聚糖酶的最适pH 值

5结论

5.1实验结果表明，在50℃、pH6.50条件下，底物浓度为1%，酶促反应时间为15min ，DNS 显色5min ，于波长540nm （标准曲线和样品测定必须使用同一波长）处测吸光度值比较适宜。

5.2在检测过程中应正确把握pH 值、温度、底物浓度。有些细节问题对木聚糖酶检测也会产生一定的影响（如计时的离心速度、摇匀力度和次数、搅拌时间等）。精确性、

5.3在木聚糖酶活性检测过程中，不但要注意且正确把握影响酶制剂活性测定的主要因素及关键点，而且要关注其他细小影响因素，努力把酶制剂检测的每一个要点和步骤做好。

5.4比色皿老化发毛、刷洗不干净，分光光度计调校不准或预热不到位，都会影响到测定数据的准确性。测定时对

Figure 4. Optimum pH of xylanase

由图4可知，该酶的酶活变化趋势符合钟形曲线，随着pH 值的增加酶活呈上升趋势，在pH 值为6时达到高峰，随后开始下降，在pH 值为5.5~7.5时可保持85%以上的活性。当低于pH5和高于pH8时酶活急剧下降，在pH 值为3和pH 值为9时酶活仅为最适pH 值时的0.9%和17.3%。

pH 值对酶活性的测定结果影响很大，但木聚糖酶的最适pH 值也会随着底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变。因此，最适pH 值也不只是在一定条件下才有意义。pH 值影响酶活性的原因可能有3个方面：①过酸或过碱使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，使酶活性丧失；②pH 值影响了底物的解离状态，使底物不能和酶结合或结合后不能生成产物；③pH 值影响维持酶分子空间结

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2009年第11期总第212期··153

柚皮活性物质含量及其活性测定

吴勤民

（江苏食品职业技术学院，江苏淮安223001）

摘要：对紫外分光光度法测定柚皮中的黄酮含量及活性测定进行了研究，实验结果表明：紫外检测的最佳波长为360nm ，测定上限

可达到8.0mg/L，下限为0.1mg/L，回收率为97%，RSD 为2%~3%；柚皮提取物具有较强的降低MDA 和增加SOD 活力的作用，且效果明显；柚皮提取物对脂肪有很强的抗氧化作用，但耐热性不强；80%乙醇洗脱组分A 41、B 41在0.9g/L时清除DPPH 和超氧离子自由基能力与槲皮素相当，但柚皮提取物混合相在低浓度时清除羟基自由基活性最为明显。关键

词：柚皮；紫外分光光度法；自由基

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2009）11-0153-04

中图分类号：O657.32

Determination of content and activity of pomelo peel

WU Qinmin

(JiangsuInstitute of Food and Vocational Technology, Huaian 223001, China)

Abstract ：The content and activity of flavonoids in pomelo peel were determined using UV spectrophotometry in the study. The results showed that the optimal ultraviolet detection wavelength was 360nm. The maximum and minimum detection limints were 8.0mg/Land 0.1mg/L,respectively. The recovery yield and RSD under the optimal conditions were 97%and 2%~3%,respectively. Extraction of pomelo peel could remarkably decrease the value of MDA and increase the activity of SOD. The extract of pomelo peel had a strong antioxidative effect but was heat-liable. The extraction of

-, which was equal to that of pomelo peel (0.9g/L)after diluted by 80%ethanol was found to have the highest clearing activity of DPPH and O 2·

quercetin. The extraction of pomelo peel mixture at low concentrations had a high activity of clearing the ·OH. Key words:pomelo peel; ultraviolet spectrophotometry; free radical

柚皮占整个柚子的43%~48%（实测），含有非营养性生理成分（如黄酮类化合物、类柠檬苦素等），这些成分高化痰、理气、抗炎、止痒等功效。于柚果实。柚皮具有止咳、

柚皮提取物具有抗氧化、抗微生物、抗癌、抑酶、抗衰老、降血糖、降血压、预防动脉粥样硬化等活性[1]。本研究将纤维素酶应用于柚皮活性成分的提取，用紫外分光光度法测定了其中黄酮类物质的含量，并对柚皮提取物及其不同溶剂洗脱组分进行了动物实验和体外活性测定，以期为柚皮的深度开发和应用提供参考。1材料与设备1.1材料

柚子：市售；芦丁标准品：Sigma 公司；大豆油、DPPH ：1，1-二苯基-2-苦肼自由基、纤维素酶：NOVO 公司；亚油酸：大连医诺生物有限公司；氮蓝四唑（NBT ）：南京奥多

收稿日期：2008-11-15

北京拜尔迪生物；福尼生物科技有限公司；细胞色素C ：核黄素、甲硫氨酸：广州日康；V C 、硫酸铜、过氧化氢等均由湖北辰康有限公司提供。为分析醇。实验小鼠：1.2仪器

752紫外可见分光光度计：上海荆和分析仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE52）：上海普渡生化；微波发生器：烟台凯尔微波系统有限公司；冷冻干燥机（FD-1-50）：北京博医康。2实验方法

2.1柚皮活性成分的提取

将10kg 柚皮洗净，切成小片后打浆，将固体纤维素酶溶解于0.50mmol/L的Tris-HC1缓冲液（pH5），配制成0.045纤维素酶溶液与浆液按照1∶5的比例混合，U/mL的酶溶液；

酶解30min 后，将酶解液于60℃真空浓缩干燥后干燥，以60%vol乙醇进行提取，500W 微波处理3次，每次保持1.5

作者简介：吴勤民（1973-），女，江苏淮安人，讲师，研究方向为食品营养及功能因子开发。

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同一批次产品用同一仪器或同一产品用不同仪器，记录并分析测定结果，力求减少仪器误差及人为误差。参考文献：

[1]周晨妍，邬敏辰. 木聚糖酶的酶学特性与分子生物学[J].生物技术,2005,15（3）:89-92.

[2]佘元莉，李秀婷，宋焕禄，等. 微生物木聚糖酶的研究进展[J].中国酿造,2009（2）:1-4.

[3]张勤良，王[4]张红莲，姚

璋，许时婴. 中性木聚糖酶在面包制作中的应用[J].食品斌. 木聚糖酶的分子生物学及其应用[J].生物技术通报,

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