分光光度法测定羟基自由基捕获剂的研究进展_任瑞妮
第40卷,第3期2014年6月安徽化工
Vol.40,No.3Jun.2014
19
分光光度法测定羟基自由基捕获剂的研究进展
任瑞妮,付柯,冯巩,何舜,王宏
(陕西理工学院化学与环境科学学院,陕西汉中723001)
(DMSO)、茜素紫、邻二氮菲、水杨酸、亚甲基蓝、细胞色素C和溴邻苯三酚红等捕获剂摘要:主要介绍了分光光度法测·OH用二甲基亚砜的适用环境,并评价了其优缺点。关键词:分光光度法;羟基自由基;捕获剂doi :10.3969/j.issn.1008-553X.2014.03.006中图分类号:O657.31
文献标识码:A
文章编号:1008-553X(2014)03-0019-03
(·OH)具有强氧化性,主要调控生物体羟基自由基
内的动态平衡。但是如果新陈代谢时羟基自由基(·OH)生成过多,会在生物体内氧化细胞膜、蛋白质和酶等各类生物大分子,导致细胞氧化、衰老、凋亡,对细胞进行致命性伤害。故近年来对各种抗氧化性物质研究甚多。由于·OH寿命短(小于10-4s),存在浓度小,紫外分光光度计无法直接测定的缺陷,故用捕获剂对其进行追捕,转化为易于测定的物质,然后进行间接测定。
目前,一般实验室采用分光光度法检测羟基自由基,虽然这种方法干扰因素较多,但简单实用,所需设备常见。分光光度法测定羟基自由基是利用·OH容易攻击芳环化合物而产生羟基化合物的特点,在体系中加入一些探针性物质,利用生成物的量,即体系反应颜色的变化来间接测定·OH的含量[1]。捕获剂对羟基自由基乃至于生物体内多种自由基的有效捕获,将不止在仿生界,其在环境治理方面也会有重要价值。因此,对捕获剂灵敏度以及适宜条件的研究有重大意义。
性关系。同时还测定了核桃、黑芝麻等8种食物的提取物对·OH的清除作用。该法操作简便,试剂价廉易得,实验结果准确可靠,灵敏度较高。在研究体外羟基自由基的生成含量以及其清除剂的筛选等领域有较为广泛的应用。1.2茜素紫法
茜素紫作为一种指示剂,在强酸介质中呈现黄色,微酸性介质中呈玫瑰红色,中性介质中呈淡紫色,强碱性介质中呈紫色再变为黄色。Co2++H2O2反应生成羟基自由基,茜素紫与·OH发生氧化还原反应后,可以使茜素紫颜色淡化甚至褪去,吸光度值逐渐减小。加入清除剂后,吸光度值下降的速率变小,利用这一特性可间接测定清除剂的清除作用。
利用从陈皮中提取张瑞菊[4]等在波长为560nm时,
的黄酮类物质,在弱碱条件下来清除CoSO4和H2O2反
茜素紫的颜色随着黄酮类物质浓度的减应生成的·OH。
少而变淡,从而得出了陈皮中的黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性的结论。该法选择性高,而茜素紫的颜色变化程度、反应速度与Fe2+以及H2O2的浓度成较好的
需进行最佳操作方案的选择。故灵敏度线性关系。因此,
高,且准确快速[5]。这种方法对羟基自由基清除剂的选择具有一定的准确性。1.3邻二氮菲法
在pH=2 ̄9时,邻二氮菲与+2价亚铁离子(Fe2+发)生显色反应,该反应的选择性很高,而且反应生成的橙红色络合物非常稳定,其溶液在510nm处呈最大吸收峰。邻二氮菲-Fe2+被羟基自由基氧化成邻二氮菲-Fe3+
通过全波长扫描会发现,最大吸收峰消失,从而可以后,
1羟基自由基的捕获方法
1.1二甲基亚砜法
二甲基亚砜(DMSO)作为一种常见的溶剂,在
Fenton反应中作为羟基自由基探针,使·OH转化为甲基亚磺酸[2]。
在此反应中,甲基亚磺酸(MSA)能以稳定的状态存在。由于被测溶液在反应前的MSA含量为零,故生成的MSA与羟基自由基含量有一定的关系。徐向荣[3]等以DMSO作为分子探针,在波长为420nm时测定Fenton法产生的羟基自由基,成功地用于羟基自由基清除剂的选择。检测出抗坏血酸与硫脲清除羟自由基有明显的线
作者简介:任瑞妮(),专业:
20(第40卷)总第189期2014年第3期安徽化工
在此波长处测其吸光度值。吸光度值的变化能反映清除
通过测定清除剂在该波长处的剂的抗氧化能力。因此,
吸光度值,即可得知羟基自由基的含量[6]。测定时,加样
方法对结果有重要影响,需先将邻二氮菲、PBS和H2O每管加入FeSO4后立即混匀,否则会使体系局部混匀,颜色过浓,影响结果重复性。
利用邻二氮菲-金属离子-H2O2体系,任雪峰[7]等在波长510nm时测得金钱草、白玉兰中的总黄酮均具有良好的体外抗氧化活性。Fe2+被H2O2氧化为Fe3+,而Fe3+为显色离子,对吸光度的影响不容忽视。而在酸性条件下,Fe3+和缓冲溶液中的H3PO4形成稳定无色的
+(HPO4从而排除了Fe3+的干扰。Fe)配离子,
37℃水浴,50min为最实验时需控制好反应时间,
有与苯环相连的且带有孤对电子的氮硫的发色基团,在
664nm处有最大吸收峰。在一定浓度范围内,664nm吸光度值与MB浓度呈线性关系。MB分子中有一个中间价态的硫原子,其对·OH有高度的亲和性,故可捕获Fenton反应产生的·OH。MB与羟基自由基反应,生成羟化亚甲基蓝(MB-OH),颜色由蓝色变为无色。其中的硫原子处于高价态,不易被氧化;而且高价态的硫同样也不易被还原,所以亚甲基蓝作为羟基自由基捕捉剂有很好的稳定性。因此,可通过MB在664nm时吸光度值的变化来间接反映·OH的含量[10]。
杨春维[11]等利用该原理测定了环境模拟水相中Fenton反应产生的羟基自由基,表明了以亚甲基蓝为代表的噻嗪(Thiazine)类指示剂可以用来定量测定并分析环境模拟水相中Fenton试剂产生的羟基自由基。该法的羟基自由基捕获率可以达到33%,一般捕获剂都只有10% ̄20%。其精确度在各种测量方法中也是较高的[12]。且该法简便,灵敏度好,价格便宜,稳定性好,为研究自由基损伤和筛选抗自由基药物提供了一种简便易行的手段,适于环境水相高级氧化处理工艺中微量羟基自由基的检测。由于MB本身又是一种低毒性的解毒物质,因此可将其导入机体内来研究机体内的自由基损伤机理和药物抗自由基损伤的效果[13]。1.6细胞色素C
在一定浓度范围内,当Cu2+存在时,用抗坏血酸作为还原剂,能与Vc(Ⅱ)·O2生成的H2O2反应,使Cu2+还
生成·OH。随后羟基自由基使浅红色的还原型原为Cu+,
细胞色素cyto·C(Ⅱ)转化为浅黄色的氧化型细胞色素cyto·C(Ⅲ)。还原型细胞色素C在550nm处有明显的吸收峰,而氧化性没有明显的吸收峰,因而可通过测定还原型细胞色素C的含量来判断羟基自由基的生成[14]。
利用Vc-Cu2+-张艳萍[15]等通过对实验条件的改进,
·OH的清细胞色素C体系,有效测得了柚皮提取物对
除率。由于石油醚相的溶解度问题,表明了研究弱极性
物质的羟基自由基清除率不适合用细胞色素C这样的体系。因此该方法可作为强极性抗氧化剂的筛选方法之一,但实际应用较少。1.7溴邻苯三酚红法
溴邻苯三酚红(BPR)法与经典的Fenton法类似,用H2O2将Co2+氧化为Co3+,从而产生·OH。催化剂硫脲又选择性地将Co3+还原为Co2+,因此,加快了反应速率,BPR褪色增快,·OH的产率大幅度升高。谢文涛[16]等对该体系进行了最佳方案的研究,从而间接测定了羟自由操作简
佳反应时间[8]。时间过长,使时间过短,·OH生成不完全;得更多的二价铁被氧化成三价,而且H2O2会随着时间
延长而减少,从而降低了清除剂的清除率。该法对反应要求较高,影响因素多,需对其进行分析改良,然后确定最佳实验方案。但所需药品价廉易得,操作简便,故一般作为某些物质对羟基自由基的清除率的对比实验,且应用较为广泛。在抗氧化研究中检测离体实验中羟自由基的氧化效应,尤其对于离体时大量筛选抗氧化药物有重要价值。1.4水杨酸法
在利用分光光度法测定羟基自由基时,水杨酸是最常用的捕获剂,其和羟基自由基反应产物是2,3-二羟基苯甲酸和2,5-二羟基苯甲酸。2,3-二羟基苯甲酸的生成量与·OH反应的自由基的量成1∶1的关系,从而达到间接测定自由基的目的。通过对反应体系影响条件(吸收波长、反应物浓度以及反应时间、温度等)的优化,筛选出最佳反应物配比和最佳实验条件,并对其稳定性进行检测。在此基础上,再测定抗氧化剂对羟基自由基(·OH)的清除率。
盛伟等[9]利用水杨酸-乙醇-H2O2-FeSO4体系来测定三种不同的多糖在体外环境的抗氧化性。确定最佳实验方案后,测得白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇均具有较强的清除羟基自由基的能力,且随着浓度的增加,对羟基自由基(·OH)的清除能力也随之增强,呈现良好的量效关系。
因水杨酸自然氧化程度较低,故作为分子探针可以准确表示羟基自由基的生成量。且该体系反应灵敏、稳定性高,可作为抗氧化剂的筛选方法之一。
1.5亚甲基蓝法
分光光度法测定羟基自由基捕获剂的研究进展任瑞妮,等:21
测定快速,可作为简便快速筛选羟自由基清除剂的便,
方法之一,所需试剂便宜,使用广泛。1.8其它方法
用紫外-可见光分光光度计测定羟基自由基的含量以及其清除剂的清除作用,除了上述的几种捕获剂外,还有溴甲酚绿[17]、考马斯亮蓝G250[18]、孔雀石绿
[19]
(MG)、二苯基碳酰肼[20]和罗丹明B[21]等。考马斯亮蓝可被Fenton法产生的羟基自由基氧化而褪色,褪色程度与羟基自由基的量在一定范围内成正比关系,刘瑛利用此原理对抗坏血酸等9种抗氧化剂的清除羟基自由基性能进行了测定,并应用于植物提取液对羟基自由基的清除率的测定。结果表明,此方法可方便地应用于抗氧化剂的筛选。
2展望
分光光度法是利用羟基自由基使体系颜色发生变化,根据吸光度值的变化从而间接测得自由基的含量,被认为是最简便实用的羟基自由基的测定方法。由于受国内仪器和经费条件的限制,绝大部分测定羟基自由基是用分光光度法来完成的。虽然该法操作简单方便,但是间接测定干扰因素较多且不确定,需根据操作环境选择合适的捕获剂,确定最佳实验方案,尽量减少干扰因素,以尽可能达到最高效率的捕获,从而减少实验结果与体内环境的差距,使其逐渐趋于理想化。
羟基自由基的研究已不仅仅局限于生物化学领域,很多方法已在医疗、环境治理等多领域得以应用。因此,提高羟基自由基的捕获率以及灵敏度的深入研究有着重大意义。
参考文献
[1]刘建伟,杨长河.羟基自由基检测方法的研究进展[J].江西化工,
2009(2):20-24.
[2]马岚,刘祥萱.二甲亚砜作探针试剂研究Fenton反应条件[J].城
市环境与城市生态,2009,1(22):25-28.
[3]徐向荣,王文华,李华斌.比色法测定Fenton法产生的羟基自由
基及其应用[J].生物化学与生物物理进展,1999(1):65-67.
[4]张瑞菊,邢桂丽,孙海波.陈皮中黄酮类化合物的抗氧化性[J].食
品与药品,2007(11):25-27.
[5]杨春维,王栋,郭建博,等.水中有机物高级氧化过程中的羟基自
由基检测方法比较[J].环境污染治理技术与设备,2006(1):138-143.
[6]柳红,张静.不同南瓜多糖体外清除羟自由基作用的研究[J].武
汉植物学研究,2007,25(4):38-41.[7]任雪峰,吴冬青,安红钢,等.金钱草、白玉兰总黄酮的提取及体
外抗氧化性的研究[J].湖南农业科学,2010(23):128-130.
[8]刘薇,王宏君,赵建,等.邻二氮菲-Fe2+法测定保健食品的抗氧
化能力[J].食品科学,2010(18):340-344.[9]盛伟,方晓阳,吴萍.白灵菇、杏鲍菇、阿魏菇多糖体外抗氧化研
究[J].食品工业科技,2008,29(5):97-99,103.
[10]刘娇,孟范平,王震宇,等.亚甲基蓝光度法研究基于CaO2的
Fenton反应条件[J].化工学报,2011(9):146-152.
[11]杨春维,王栋.可见分光光度法检测环境模拟水相中Fenton反
应产生的羟基自由基[J].环境技术,2005(1):31-33.
[12]杨春维,王栋,郭建博,等.水中有机物高级氧化过程中的羟基自
由基检测方法比较[J].环境污染治理技术与设备,2006(1):138-143.
[13]廖力夫,何玉媛,袁亚莉,等.可见分光光度法检测Fenton反应中
的羟自由基[J].衡阳医学院学报,1996(2):130-132,134.
[14]RowleyDA,HalliwellB.Superoxide-dependentandascorbate-
dependentformationorhydroxylradicalsinthepresenceofcoppersalts:aphysiologicallysignificantreaction1983(01).
[15]张艳萍,俞远志.柚皮提取物的抗氧化活性研究[J].食品研究与
开发,2007(11):49-52.
[16]谢云涛,马国平,何玉凤,等.BPR-硫脲催化光度法对羟基自由
基的检测及清除作用[J].化学通报,2006(6):60-63.
[17]张德莉,罗光富,陈燕,等.溴甲酚绿测定Fenton法产生的羟基
自由基[J].三峡大学学报,2005(5):69-72.
[18]刘瑛,陈新,薛翠华.考马斯亮蓝G250褪色光度法测定Fenton
反应产生的羟基自由基[J].理化检验(化学分册),2010(5):17-19,23.
[19]陈建孟,潘伟伟,刘臣亮.电化学体系中羟基自由基产生机理与
检测的研究进展[J].浙江工业大学学报,2008,36(4):416-422.[20]刘德启,顾钧,丁梅香.萃取-催化氧化光度法测定H2O2的羟基
自由基[J].分析科学学,2002(2):37-39.[21]方光荣,刘洁,宋功武.罗丹明B显色检测Fenton反应产生的
羟基自由基[J].分析实验室,2004(10):59-61.□
Research Progress of Spectrophotometric Method to Determine the Hydroxyl
Free Radical Scavenger
HE Shun, WANG Hong REN Rui-ni, FU Ke, FENG Gong ,
(CollegeofChemistry&EnvironmentalScience,ShanxiUniversityofTechnology,Hanzhong723001,China)
Abstract:Theaimwastointroduceprobes’applicativeenvironmentofspectrophotometrydetermineoxhydryl,suchasdimethylsulfoxide,allizarinpurple,Phenanthroline,salicylicacid,methyleneblue,cytochromeCandbromopyrogallolred.Alsoevaluateditsmeritsanddrawbacks.