西瓜多倍体诱导及倍性鉴定的研究

西瓜多倍体诱导及倍性鉴定的研究

组员：符浩、黄玉、毛少平、赵倩、徐碧江

摘要：西瓜加倍研究具有十分重要的理论意义和经济价值" 本试验对秋水仙素诱导西瓜染色体加倍方法进行了初步探讨并研究了西瓜多倍体鉴定方法及不同倍性的性状比较。研究了秋水仙素浓度(0.1%,0.2%,0.3%,0.4%)和浸芽时间对西瓜诱导多倍体的影响，结果表明, 随浓度的升高率和成出苗株率均出现下降，变异总数分别为414和6株当浸芽12h 且秋水仙素浓度为0.1%时, 诱导率分别达到

2.4%!3.6%和2.7%。

关键词:西瓜；秋水仙素；四倍体；诱导；倍性鉴定

前言

温克莱(1916)首次提出植物多倍体的概念同时证实了人工方法诱导多倍性存在可能性植物多倍体是高等植物细胞内染色体进化的一种显著特征, 在多倍性植物的细胞内存在三个或三个以上染色体组(路易斯W:H,1984)自然界中多倍体植物普遍存在, 是种类进化和创造高产优质品种的重要途径" 据统计, 在现有植物中大约有70%一80%的物种在其进化的过程中可能经历过多倍化阶段(杨继,2001) 在高等植物中多倍体现象十分普遍和复杂, 但这些多倍体的形成途径却十分相似从目前的研究结果来看, 植物多倍体主要起源于三种途径:未减数配子融合! 体细胞染色体加倍和多精受精(王超等,2000) 。

从理论上来说, 生物体的每一个细胞均应来自受精卵, 遗传上具有相同的潜在能力，但事实上, 在完整的植物体内体细胞的变异却经常发生, 染色体数目加倍就是常见现象之一(许智宏,1985) 体细胞染色体数目加倍是由于有丝分裂异常造成的, 如分裂的分生细胞在外界条件改变下不能形成纺锤体, 有丝分裂过程停滞在中期状态, 每个染色体所复制的两个姐妹染色单体虽然彼此分开了, 却不能被拉向两极而停留在一个细胞中, 于是该分生细胞内的染色体数加倍了在幼胚或合子分生组织及普通薄壁细胞中经常发生有丝分裂异常合子或幼胚体细胞加倍产生完全多倍性抱子, 而体细胞加倍发生在普通薄壁细胞和分生组织上可能导致产生混倍J 哇的嵌合体(杨继,2001) 因而多倍体可能以芽变的方式发生, 可以从实

生苗中选出另外, 合子及幼胚在受到外界不适环境如高温刺激时也会诱导染色体加倍, 如Randoph(1932)曾用43e 一45e 高温处理新形成的玉米结合子得到四倍体, 由于效率低而未能普及。

一．诱导多倍体的方法

目前化学方法诱导多倍体是应用最广泛且最有效的方法因其操作简便、专一性强、诱变谱广等优点而迅速被育种工作者广泛接受化学方法诱导即利用化学药剂进行诱导, 目前主要应用秋水仙素, 除草剂类药剂也取得了较好的效果(GcofrianE.etal.,1997)利用化学方法诱导多倍体己在多种园艺植物如大白菜(刘惠吉等,1994) 、西瓜(Meeuistion.Fetal.,1993,zhangxPetal.,1995)、甜瓜(Adelbe JW.etal.,1993,AdelbeJW.etal.1994) 、柑橘(GmitterFGJr.etal.,1991)等植物上获得成功诱导方法可分为活体诱导和离体诱导两种方法活体诱导指通过处理植株的生长点来达到染色体加倍的目的处理部位可为种子、幼苗茎尖、幼苗生长点等, 诱变率一般比较小(黄平,1998) 具体的应用方法应方便、有效、安全和切实可行" 谭素英等(1993)通过剥去生长点外幼叶后用1%秋水仙素的羊毛脂膏涂抹和0.2%的秋水仙素水溶液浸芽处理, 显著提高了西瓜变异频率和秋水仙素处理效果周泉根据多年的生产经验认为, 采用0.25%秋水仙素溶液滴苗处理西瓜效果最好, 处理期间温度控制在18e 一25e 之间刘惠吉等(1994)用0.4%的秋水仙素水溶液处理短白梗白菜具2一3片真叶的幼苗, 选育出四倍体白菜/热优2号0, 用0.2%的秋水仙素溶液处理耐寒黑菜子叶期的幼苗生长点获得四倍体" 由于植株整体水平诱导方法简便, 易于掌握, 目前四倍体西瓜和甜瓜的诱导主要采用此方法, 但传统的活体诱导处理方法诱导频率低、嵌合率高, 易受环境条件影响及部分植株为嵌合体并易发生回复突变, 同时刚诱导成的四倍体的育性显著低于二倍体, 甚至有相当比例的四倍体自交困难, 使育种周期大为延长而离体培养过程中利用诱变剂的诱导技术就能克服活体诱导技术中存在的问题离体培养可提高多倍体诱导率, 降低嵌合率西瓜组织培养开始于20世纪70年代初期"Andrus 等(1971)用无籽西瓜下胚轴进行培养, 诱导形成芽, 建立了无籽西瓜无性系许智宏和Barneslr(1979)也报道了利用组织培养离体繁殖无籽西瓜苗的方法，近年来, 生物技术的发展促进了植物组织培养结合秋水仙素诱发多倍体的研究ComPton 和Gray 等(1996)研究表明, 采用子叶作为外植体进行西瓜离体培养可有

效产生可育、非嵌合四倍体植株, 纯合率达90%,比用秋水仙素处理二倍体西瓜幼苗获得的四倍体植株纯合率高得多(幼苗处理的嵌合率高达36%一75%)Zhang等(1995)在西瓜幼胚子叶不定芽再生的前7天在再生培养基中添加0.05%秋水仙素, 使再生植株中四倍体的频率由对照(不加秋水仙素) 的8%提高到52%,大大提高了组织培养再生四倍体的频率和效率离体培养过程中用化学药剂诱导材料加倍可大体分为两种, 一是直接诱导法, 即将材料放在含诱变剂的培养基中处理一段时间, 再转到不含诱变剂的培养基中培养; 二是间接诱导法, 即先在不含诱变剂的培养基中培养一段时间, 再转移到含诱变剂的培养基中培养, 培养基可是固体培养基, 也可是液体培养基一般来说, 直接处理外植体产生的药害大, 经预培养后再用诱导剂处理可提高四倍体获得率,Hansen 一AL 等(2000)研究表明, 预培养时间从0天延长到10天时, 四倍体频率从10%提高到25%一般认为MS 培养基比其它培养基更适宜于西瓜组织培养基本培养基, 可附加不同成分有利于西瓜生长的药剂如Ms 盐、甘氨酸、维生素B6等, 凝固剂多为7g/L琼脂; 碳源为309/l蔗糖" 除基本培养基外, 植物生长调节剂的选择被认为是组织培养能否获得成功的关键因素普遍认为BA 是诱导西瓜不定芽发生最有效的生长调节剂不同细胞分裂素对西瓜上胚轴不定芽发生和出芽数有不同程度的影响林友豪等(2003)结果表明:6一BA 高浓度和低浓度对芽的分化作用不明显, 当6一BA 的浓度达到2.0一3.0mg/L时, 能显著促进不定芽的形成魏瑛等(1999)以MS 培养基为基本培养基附加NAA 、6一BA 、KT 和2,4一D, 采用正交试验设计研究了不同激素配比对西瓜子叶和胚轴愈伤组织形成的影响结果表明:6一BA 对子汗卜愈伤组织形成的影响最大, 胚轴对激素的反应比子叶敏感二甲基亚矾(DMSO)是运输化学物质进入组织的一种载体, 在组织培养过程中加入DMSO 可作为秋水仙素的一种调节剂, 促进多倍化(HauthalHG,etal.,1975)离体培养中除了利用秋水仙素作为诱导剂外, 除草剂类药剂的应用也在扩大生物碱、除草剂在某些植物种中的多倍化程度高, 药害轻在这些化合物中,oryzahn(一种二苯基胺类除草剂) 、Pronamide(一种苯基酞胺除草剂) 和氟乐灵(一种二苯基胺类除草剂) 比秋水仙素对植物微管蛋白有更高的亲和性, 低浓度条件下具有更高的微管蛋白解聚能力, 比秋水仙素更有效M.vanDuren 等(1996)用30mo 比的O 理zalin 添加20%(v/v)的nMso 获得29一%的四倍体, 对照用5.ommoljL 秋水仙素添加20,0(v/v)的nMsO 处理仅得23.20,0的四倍体" 氟

乐灵(五pingzhaoetal.,995) 在甜菜胚培和甘蓝胚培培养中已有成功的报道, 在众多园艺植物多倍体诱导上的应用效果还有待进一步研究离体培养条件下外植体类型不同, 芽再生率有很大不同" 西瓜茎尖具有非常高的增殖能力, 容易成苗马国斌等(2002)利用茎尖进行离体诱导西瓜四倍体西瓜子叶是诱导不定芽发生的适宜外植体, 一般苗龄为4一sd 、颜色由黄变绿时的子叶不定芽再生的频率较高张兴平等(1996)研究表明:近胚轴端中心叶脉处的子叶组织再生能力最强, 而远离胚轴的子叶边缘组织再生能力较差未成熟胚再生频率更高, 且受基因型的影响更小采用二倍体西瓜自交授粉后20一23天的西瓜未成熟胚子叶中部组织离体诱导四倍体, 诱导率高, 不易产生嵌合体石晓云等(2003)通过愈伤组织获得四倍体植株, 且诱导率高于通过芽丛与单芽的诱导率Adelberg 等（1993) 对甜瓜子叶再生四倍体进行了探索和研究, 结果表明从授粉后18天到22天的幼胚子叶再生植株中高达50%为四倍体, 而从授粉后34天的成熟胚子叶再生的植株中只有7%为四倍体从子叶不同部位再生的植株, 四倍体的频率也大不相同, 近胚轴端子叶组织再生的植株四倍体频率显著高于从其他子叶部位再生的植株在5.tuberosum 和

5.commersonii 组织培养中, 用叶作外植体的芽再生率略高于茎外植体的芽再生率, 用叶外植体获得四倍体的频率为

(TeodoroCardictal.,1993)。 40%,嵌合率较低

二．多倍体的鉴定

在诱导多倍体过程中, 准确及时鉴定出多倍体可以缩短培养周期, 提高四倍体育种工作效率多倍体由于染色体加倍, 其外部形态特征和内部特征都发生了明显变化根据这些变化就可区别二倍体与多倍体一般而言, 以外观检验方法观察处理后所形成的植物器官是否明显增大为基础, 组织化学、叶绿体计数为辅助, 取根尖或花粉母细胞组织在电子显微镜下检查染色体数来确定, 切忌以个别特征为依据妄言断之(裴新澎,1965) 目前常用的几种鉴定方法如下所述。

2.1形态学鉴定方法

形态学鉴定法是最直观的鉴定方法多倍体植物由于染色体加倍, 其外部形态特征和二倍体有明显的差别, 主要表现在根、茎、叶、花器和果实的形态和大小上comPton 和Gray(1996)研究发现子房直径、雄花的花瓣和花药直径、叶长与叶宽比是西瓜倍性水平很好的标志, 四倍体子房直径是二倍体子房直径的1.4

倍、四倍体和二倍体雌花的花瓣直径和子房长度没有差别、而雄花中, 四倍体花瓣直径和花药直径大于二倍体的、二倍体的叶长与叶宽比大于四倍体的叶长与叶宽比、整个生长发育期观察记载植物学性状(如茎粗壮程度、生长期、发育期、叶厚、叶色、叶形指数、花果大小) 均可判定在植株生长的不同时期如从四个阶段来识别:幼苗期、营养生长期、花期和果实发育期的典型特征, 就能够有效地将四倍体植株筛选出来(龚宗俊,1993) 。

2.2染色体计数法

多倍体加倍后最本质的特征是染色体加倍, 因此, 染色体计数法是最直接最准确的鉴定方法之一(李步勋等,1999) 不但能区别倍性而且还能鉴定是整倍性或非整倍性的变异TeodoroCardi(1993)用茎尖染色体计数法证实了用叶绿体计数法鉴定出的马铃薯四倍体40%的正确性杜胜利等(2002)采用去壁低渗法进行染色体制片, 成功鉴定出黄瓜加倍体F 一BSG 法、去壁低渗法观察西瓜染色体效果比较好(刘文革等,2002) 郭启高等(2000)在离体培养过程中利用不定芽叶尖染色体计数, 在组织培养早期100%检出倍性。

2.3 细胞形态学鉴定法

与二倍体相比, 多倍体的细胞学形态表现为保卫细胞叶绿体数目增多ComPton 和Grays(1996)通过再生植株叶片每对保卫细胞中叶绿体数目多少鉴定二倍体和四倍体植株每株四倍体西瓜植株中, 平均每对保卫细胞有19个叶绿体, 二倍体植株中每对保卫细胞有11个叶绿体这样, 随倍性从Zn 到4n, 每对保卫细胞叶绿体密度增加系数为1.7, 用10株四倍体后代和四倍体与二倍体杂交获得的三倍体种子来确认了其四倍性此方法也在黄瓜倍性加倍(杜胜利等,2002)

和用秋水仙素处理获得的西瓜幼苗上得到了验证(McCuistion.F.etal.,1993)eompton和Gray(1999)用荧光黄(FDA)对离体培养小植株的叶片进行染色, 保卫细胞叶绿体经FDA 染色后会发出荧光, 用显微镜和UV 光观察就可确定保卫细胞叶绿体数目, 二倍体和四倍体植株中每对保卫细胞的叶绿体数目平均为9.7和17.8" 刘文革等(2005)研究不同倍性西瓜的叶表皮微形态特征结果表明, 随着西瓜倍性的增加, 叶片保卫细胞和表皮细胞增大, 叶片单位面积上的气孔和表皮细胞的数目减少, 细胞的大小与西瓜倍性呈正相关, 单位面积上的细胞数目与西瓜倍性呈负相关通过二乙酸盐荧光黄(FDA)荧光记数法观

察4x 、3x 和2x 的叶片保卫细胞中的叶绿体数目分别为9.9土3.4, 巧.9士

2.2,11.5士1.5, 其比例约为4:3:2,与西瓜的倍性一致" 谭素英等(1985)研究认为在西瓜上叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性常月梅(2000)认为:气孔大小、保卫细胞大小及叶绿体数与倍性成显著正相关, 相关系数达0.8以上, 而气孔密度与倍性成负相关根据保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的数目, 可以有效区分倍性(SariN等,1999) 。

三．材料和方法

3.1 实验材料

普通西瓜种子

3.2实验方法

浸种:将种子放入55度一60度温水中处理约15分钟, 杀死种子表面病菌, 处理过程要不断搅拌使之迅速降温到28e 一30e, 然后在此温度浸种8一12小时。 催芽:种子浸种后, 捞出清洗一遍, 用布包好, 置于28一30e 下催芽, 催芽过程中清洗种子, 有利于进行呼吸作用, 经24小时左右便开始出芽。

播种定植:催芽后在穴盘内播种, 芽向下" 育苗基质为泥炭:蛙石=2:l在播种好的穴盘上均匀覆盖上一层蛙石后浇透水当幼苗为两叶一心时定植, 株、行距按照0.5mx0.2m 。

田间管理:西瓜适宜生长温度为25一犯e, 夜温不低于18e 采用立体栽培方式, 单蔓整枝, 每个处理为一小区, 第二或第三雌花坐果, 每株留一瓜水肥伸蔓初期, 每667m2施三元复合肥25kg 果实膨大期要追肥灌水,667m2追施复合肥20一25kg 、尿素10kg ，采用人工辅助授粉，病虫害防治与大棚栽培管理相同。

3.3 试验设计

用清水洗净西瓜种子, 然后浸入用上述四个秋水仙素浓度水平及清水作对照进行处理, 设处理时间为24h 和48h ，处理种子数见表2, 每处理设三次重复，处理后及时用清水冲洗西瓜3一4次, 用纱布包好移入催芽箱在28度左右下催芽播种, 移栽定植。

3.2倍性鉴定

采用染色体压片法观察染色体数目，采用去壁低渗法, 对西瓜体细胞进行处理和观察:将西瓜种子用清净凉水(25e左右) 浸泡12h, 在33e 左右温度条件下催芽, 待大部分胚根长到1.ocm 左右是切取根尖, 在0.ooZmol/L8一轻基喳琳溶液中预处理2一5h(蒸馏水洗净),0.075mol 几KCI 水溶液中前低渗20min(蒸馏水洗净),2.5%纤维素酶+2.5%果胶酶的混合酶液(1:l)中酶解去壁(蒸馏水洗净), 蒸馏水后低渗20min, 甲醇:冰醋酸(3:l)的固定液中固定12h 以上, 制片, 火焰干燥,10%的Giemse 染色液染色(缓冲液PH6.8) 压片镜检,OlympusBH 一2型显微镜观察和照相记录。

撕取叶片下表皮, 置于载玻片上, 滴1滴蒸馏水, 盖上盖玻片, 在万能荧光显微镜下观测气孔保卫细胞用仪器自带软件系统测气孔保卫细胞的长度" 拍照并计算。气孔密度和保卫细胞叶绿素数目。

四．结果与分析

有不少发芽率大于70%,故需对作反正弦变换不同秋水仙素浓度浸种, 两个试验材料48h 处理的发芽数均小于24h 的发芽数说明不同秋水仙素浓度浸种, 随浸种时间的增加, 不同品种的发芽数均表现逐渐降低以/05250为试材,48h 发芽数比24h 的低4.9%。