蛋白检测方法
蛋白检测方法
一、微量凯氏(Kjeldahl )定氮法
含氮有机物与浓硫酸共热, 即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:
H2NCH2COOH+ 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。
计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、双缩脲法(Biuret 法)
蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。在碱性溶液中,蛋白质与Cu2+形成紫色络合物,此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比,而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10ug 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、Folin —酚试剂法(Lowry 法)
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂配制较为困难,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin —酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:? 在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin —酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的含量成正比。
Folin —酚试剂法最早由Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸钠(1%),硝酸钠(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时,加Folin —酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH 条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg 。通常测定范围是20~250mg 。
四、紫外吸收法
由于蛋白质分子中,酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处,其吸光度与蛋白质含量成正比,可用作定量测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,利用280nm 进行紫外检测,来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。
此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH 的改变而有变化,因此要注意溶液的pH 值,测定样品时的pH 要与测定标准曲线的pH 相一致。
五、考马斯亮兰法(Bradford 法)
1976年由Bradford 建立的考马斯亮兰法(Bradford 法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰由465nm 变为595nm ,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm 下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。
Bradford 法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g —球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS )和0.1N 的NaOH 。(如同0.1N 的酸干扰Lowary 法一样)。
(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
六、BCA 比色法
在碱性溶液中,蛋白质将Cu2+还愿为Cu+再与BCA 试剂(4,4´-二羧酸-2,2´-二喹啉钠)生成紫色复合物,于562nm 由最大吸收,其强度和蛋白质浓度成正比。此法的优点是单一试剂、终产物稳定,于lowry 法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其是在TritonX-100,SDS 等表面活性剂中也可以测定。其灵敏度范围一般在10~1200 ug/ml。
表 五种蛋白质含量测定方法的比较
从以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特点和优势,如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来,最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法) 效率最高,无论是测定时间,灵敏度还是受干扰程度,都是比较占优势的。
实验六 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G -250法)
一、目的
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质,提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G -250法是比色法与色素法相结合的复合方法,简便快捷,灵敏度高,稳定性好,是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G -250法测定蛋白质含量的原理,了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理
考马斯亮蓝G -250是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0~1000μg范围内,蛋白质一色素结合物在 595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器
(1)分析天平
(2)具塞刻度试管 10ml× 8
(3)吸管 0.lml×I ,lml×Z ,5ml×I
(4)研钵
(5)漏斗
(6)离心管 10ml
(7)容量瓶 10ml
(8)离心机
(9)721型分光光度计
2.试剂
(1)标准蛋白质溶液 称取10mg 牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml ,制成 100 pg/ml 的原液。
(2)考马斯亮蓝G -250蛋白试剂 称取100mg 考马斯亮蓝G -250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m /v )的磷酸 100ml ,最后用蒸馏水定容到 1000ml 。
此溶液在常温下可放置一个月。
3.材料
绿豆芽
四、操作步骤
1.标准曲线的制作 取6支具塞试管,编号后,按下表加入试剂。
盖上塞子,摇匀。放置2min 后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。
2.样品中蛋白质含量的测定
(1)准确称取约200mg 绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml 蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000r /min ,10min ),将上清液倒入10ml 容量瓶,再向残渣中加入2ml 蒸馏水,悬浮后再离心10min ,合并上清液,定客至刻度。
(2)另取1支具塞试管,准确加入0.l ml样品提取液,再加入0.9 ml蒸馏水,5ml 考马斯亮蓝G -250试剂,充分混合,放置2min 后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm 波长下比色,记录吸光度。
五、结果处理
根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg),按下式计算:
样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=(查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(ml ))/(样品鲜重(g )×测定时取用提取液的体积(ml ))
六、注意事项
比色应在出现蓝色2 min~l h内完成。
七、思考题
1.考马斯亮蓝G -250法测定蛋白质含量的原理是什么?还有哪些蛋白质定量法?
2.如何正确使用分光光度计?
参考文献
鲁子贤。蛋白质化学。北京:科学出版社,1981
文树基。基础生物化学实验指导。西安:陕西科学技术出版社,1994
张龙翔.生物化学实验技术。北京:人民教育出版社,1981
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量定
作者:吕淑霞 来源:生物秀 时间:2008-5-21
一、目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm ;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry 法还高
4 倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL ,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
新鲜绿豆芽
2.主要仪器
(1)分析天平、台式天平
(2)刻度吸管
(3)具塞试管、试管架
(4)研钵
(5)离心机、离心管
(6)烧杯、量筒
(7)微量取样器
(8)分光光度计
3.试剂
(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg 牛血清白蛋白,溶于100mL 蒸馏水中,即为1 000μg/mL 的原液。
(2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制:称取100mg 考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W /V )的磷酸100mL ,最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
(3)乙醇
(4)磷酸(85%)
四、操作步骤
1.标准曲线制作
(1)0~100μg/mL 标准曲线的制作:取6 支10mL 干净的具塞试管,按表1 取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm ,并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
(2)0~1 000μg/mL 标准曲线的制作:另取6 支10mL 具塞试管,按表2 取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为0~1 000μg/mL 的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
(1)待测样品制备:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中,加2mL 蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.5~1h 以充分提取,然后在4 000r/min 离心20min ,弃去沉淀,上清液转入10mL 容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。
(2)测定:另取2 支10mL 具塞试管,按下表取样。吸取提取液0.1mL (做一重复),放入具塞刻度试管中,加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂,充分混合,放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色,记录光密度OD595nm ,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X (μg)。以标准曲线1 号试管做空白。
五、结果计算
式中:X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量(μg)。
六、附 注
1.Bradford 法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2.有些阳离子,如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。
3.蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速,在2min 左右反应达到平衡;其
结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低。
七、思考题
1.制作标准曲线及测定样品时,为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合?
参考答案
1.将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分,并且使整个反应液均一,否则在比色测定时,结果会有较大偏差,使标准曲线的制作不标准,后续的测定结果就不可靠。
蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)
点击次数: 1314 作者:佚名 发表于:2009-09-13 00:00 转载请注明来自丁香园 原理:这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm 处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm 的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液:
1)Bradford 储存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG 蓝
室温下长期保持稳定。
2)Bradford 工作液
425ml 双蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,可保存数周,但在使用前需要过滤。
3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA )
做标准曲线:
取样品即可测量。
注意事项:
1、样品制备,样品制备是做好2-d 的关键,样品中离子浓度不能过大,最好用新鲜的样品提取蛋白质,如果不确定蛋白提取情况,建议先跑sds-page 检验。
2、上样量的问题, ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng 之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择,根据不同样品选择不同pH 值。
4、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度需调整。
考马斯亮兰法(Bradford 法)测定蛋白浓度
(一) 实验原理
双缩脲法(Biuret法) 和Folin? 酚试剂法(Lowry法) 的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford 建立的考马斯亮兰法(Bradford法) ,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm 变为595nm ,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm 下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。
Bradford 法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用 g?球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N 的NaOH 。(如同0.1N 的酸干扰Lowary 法一样) 。
(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
(二) 试剂与器材
1. 试剂:
(1)标准蛋白质溶液,用 g?球蛋白或牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg 考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀释至1升。
2. 器材:
(1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支
(三) 操作方法
1. 标准方法
(1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml ,然后用无离子水补充到0.1ml 。最后各试管中分别加入5.0ml 考马斯亮兰G-250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除) 。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
(2)加完试剂2~5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm 处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O 加5.0mlG-250试剂。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色) ,可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg 牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml),可将取样量(包括补加的水) 加大到0.5ml 或1.0ml ,空白对照则分别为0.5ml 或1.0ml H2O,考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0ml ,同时作相应的标准曲线,测定595nm 的光吸收值。0.05mg 牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。