溶菌酶的研究进展_陈艳
第26卷第2期2009年4月
生物学杂志J OURNAL OF B I O LOGY
Vo l 26 No 2
Apr , 2009
do i 10 3969/j issn 1008-9632 2009 02 064
溶菌酶的研究进展
陈 艳, 江明锋, 叶煜辉, 刘勇涛, 李生伟
(西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 610041)
摘 要:溶菌酶普遍存在于动物、植物和微生物中。溶菌酶是一种小分子碱性蛋白, 长期以来一直被作为一种 模型 体系, 用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。介绍了溶菌酶的来源、结构、性质、作用机制。并对近年来其在食品工业、医学和酶工程中的应用进行了综述; 分析了溶菌酶应用中存在的主要问题, 并对其应用前景进行了展望。关键词:溶菌酶; 抗菌机理中图分类号:Q 556
文献标识码:B
文章编号:1008-9632(2009) 02-0064-03
对溶菌酶的研究始于20世纪初, 人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶, 因其具有溶菌
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作用, 故命名为溶菌酶。1937年Abr aha m 和R obi nson 从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体, 揭开了研究溶菌酶的历史篇章。它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内, 其中在蛋清中含量最丰富(约0 3%) 。在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶, 只是含量差异较大。
1 溶菌酶的理化性质及空间结构1 1 理化性质
溶菌酶(Lysozy m e) 是水解酶的一种, 又称为胞壁质酶(mura m i dase) 或N 乙酰胞壁质肽聚糖水解酶(N -acetyl m ur a m idegl ycanohydrlase) 。溶菌酶是一种碱性蛋白质, 在酸性环境下, 溶菌酶对热的稳定性很强, p H 值3 0时96 加热处理15m i n 仍能保持87%的酶活性。在自然条件下, 大多数溶菌酶化学性质稳定, 即使当p H 值在1 2~11 3范围内剧烈变化, 其酶结构仍维持不变, 活性也不受影响。但碱很容易使酶活性遭到破坏, 当处于碱性p H 值范围时, 溶菌酶的热稳定性就很差
[2]
其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究进展都是利用溶菌酶获得的。
目前, 鸡蛋清溶菌酶HE W L 的酶学性质、分子结构、催化机理乃至酶蛋白基因结构已研究清楚, 并成为研究蛋白质结构与功能的一个重要模式蛋白。已知HE W L 是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链, 含有4对二硫键, 三维结构为一较紧密的椭球形; G lu35、A sp52及T r p62残基是酶活性必需基团; 同时A sp101、A rg114、T r p108等残基对 底物 酶复合物 的形成也起着重要作用, 该酶活性受组氨酸和N 乙酰葡糖胺的抑制。对植物溶菌酶活性中心的研究较少, 木瓜溶菌酶中T rp 残基不参与底物的结合, 活性中心除包括 COO H (A sp /Gl u) 外, 还必需一个Cys 。而且, 该酶受组胺抑制基本上不受N 乙酰葡糖胺抑制, 这些与HEWL 有所不同。赖晓芳
[4]
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等采用化学修饰等方法, 对萝卜溶菌酶活性中心进行了初步研究, 他们采用脱氨再生几丁质凝胶亲和层析从萝卜叶中获得了PAGE 均一的溶菌酶, 并通过微量蒸发扩散法获得其结晶。用p H 动力学研究方法和化学修饰法对酶的活性中心进行了初步研究。实验结果表明: COOH (G l u /Asp) 基团、Trp 及H i s 残基可能为酶活性所必需。对T yr 、Cys 、Ser/Thr残基修饰后, 酶活性基本上不受影响。同时, 酶活性受到组胺和N 乙酰葡糖胺抑制。并且对萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶的活性中心的相互差异进行了讨论。现有情况表明萝卜溶菌酶活性中心与HE W L 可能不同, HE W L 的活性中心只包括 COO H (A sp/Glu) 和Trp 残基; 亦与木瓜溶菌
。
溶菌酶在干燥条件下, 室温可长期保存, 其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末, 无嗅, 味甜, 易溶于水, 不溶于丙酮、乙醚。1 2 空间结构
在过去很长一段时间中, 溶菌酶一直被当作一种研究蛋白质空间构象、酶动力学及分子进化的理想模型。
收稿日期:2008-06-20
作者简介:陈 艳(1983-), 女, 满族, 黑龙江, 硕士研究生, 专业方向:分子生物学, E -m ai:l cyaita831227@163 co m; 通讯作者:江明锋(1971-), 男, 羌族, 副教授, 博士, E-m ai:l m i ngf eng ji ang @vi p si n a co m 。
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酶的不同, 其活性中心除含 COOH (G lu /Asp) 基团外,
还含有-S H 基团。用I AA 和DTNB 对萝卜溶菌酶进行化学修饰, 酶活性基本不变, 用EII m an 试剂法也测不出酶分子含有游离 S H 基团, 只测得酶分子中含有2 11mo l SH 蛋白质的二硫键存在, 所以萝卜溶菌酶活性中心可能不含游离巯基。另外, HE W L 受组胺和N 乙酰葡糖胺显著抑制; 而萝卜溶菌酶也受组胺显著抑制, 但基本上不受N 乙酰葡糖胺抑制; 木瓜溶菌酶不仅受组胺显著抑制, 而且受N 乙酰葡糖胺抑制也较强。这些差异可能反应了萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶在功能上的分化。
2 溶菌酶的分类
溶菌酶的底物特异性很强, 不同来源溶菌酶作用的底物不同。按溶菌酶的来源可分为蛋清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶。按作用细胞壁不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种, 一种是作用于 1, 4糖苷键的细胞壁溶解酶, 另一种是作用于肽链 尾 端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶大体分为5种:(1) 内N 乙酰己糖胺酶, 此酶同于鸡蛋清溶菌酶, 破坏细菌细胞壁肽聚糖中的 1 4糖苷键。(2) 酰胺酶, 切断细菌细胞壁肽聚糖中N 乙酰氨基葡萄糖胺与肽 尾 之间的N 乙酰胞壁酸 L 丙氨酸键。(3) 内肽酶, 使肽 尾 及肽 桥 内的肽键断裂。(4) 1 3、 1 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶, 此酶分解酵母细胞的细胞壁。(5) 壳多糖酶, 这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶
[5]
用公式计算出酶活力。不同酶活的标准酶液对应不同的 E , 而据此 E 又可算出所用标准酶的酶活, 从而可验证检测的准确性
[6]
。
4 溶菌酶的应用
4 1 在食品工业中的应用
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质, 又具有溶菌作用, 因此可用作食品防腐剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐, 溶菌酶属于冷杀菌, 在杀菌防腐过程中不需加热, 因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用, 尤其对热敏感的物质更具有重要意义
[7]
。还可以添加到乳粉中, 使牛乳人乳
化, 以抑制肠道中腐败微生物的生存, 同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外, 还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。
4 2 在生物工程研究中的应用
随着生物科学的发展, 溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶, 用以制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等, 利用其专一性水解细胞壁的特点, 有助于人们对细胞壁细微结构的认识, 为我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的基础, 同时作为是一种重要的破壁酶, 在原生质体的制备方面提供了新的方法, 因此溶菌酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。
4 3 在医疗中的应用
4 3 1 溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用溶菌酶对G 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用, 对大
-肠杆菌、普通变球菌等G 也具有一定程度溶解。此外, 溶菌酶与抗菌素合用效果更佳, 因而, 溶菌酶广泛应用于医药行业, 如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症, 尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果
[8]
明显。
4 3 2 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用
戴清源等报道, 正常情况下, 人体尿液中一般只存在少量溶菌酶, 因此测量尿中溶菌酶含量, 有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时, 烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍, 也可在尿液中检出, 有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。此外, 血清中溶菌酶含量高低对白血病的诊断起辅助作用。4 4 溶菌酶在畜禽饲料中的应用4 4 1 用作饲料防腐剂和杀菌剂
由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质, 无毒性, 是一种安全性高的饲料酶, 它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁, 而不能作用于其它物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用; 对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一
[9]
+
。
3 影响溶菌酶活力的因素与酶活力的测定方法3 1 影响酶活的因素:包括温度、p H 值、化学物质、络
合作用等。
3 2 溶菌酶酶活力的测定方法通常有3种。
(1) 以细胞壁作为底物, 用作用前后浊度的变化表示酶活力的大小。
(2) 以溶壁小球菌培养液作为底物, 用作用前后浊度的变化表示酶活力的大小。由于这两种方法都是用固液两相反应, 难以准确测定反应速度, 故有人将水溶性多糖已二醇甲壳质制备均匀态底物, 用来测定酶活力。
(3) 分光光度计测定法, 在450n m 处, 把一定量的菌体冻干粉或冰浴解冻的溶壁微球菌液溶解于一定量的磷酸盐缓冲液中, 使吸光度值在1 3左右, 此底物溶液以及标准酶液在温度25 水浴中保温。用1c m 比色皿装2 5mL 底物于水浴中, 加入0 5mL 酶液开始计时, 记下反应1m i n 时的读数E1以及反应2m i n 时的读数E2,
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定的杀灭作用; 与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用, 具
有良好的防腐作用。在饲料中添加溶菌酶可防止霉变, 延长饲料的贮存期, 减少不必要损耗
[10]
主知识产权的溶菌酶相关产品并实现产业国际接轨就显得尤为重要。
我国具有丰富的动植物资源可以为溶菌酶的研究提供更广阔的空间。溶菌酶可作为潜在的抗生素替代品添加剂具有较为广阔的前景。通过基因工程途径生产溶菌酶可能较大程度地降低成本, 以推动其在医药业、食品加工业、畜牧业等领域中的应用。
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。
4 4 2 具有防治仔猪腹泻的作用
[11]
沈彦萍等报道, 溶菌酶对防治仔猪腹泻有显著作用, 可达到抗生素的使用效果, 治愈率达80%以上。溶菌酶与免疫球蛋白的功能紧密联系, 体内溶菌酶主要来自嗜中性白细胞、单核细胞及吞噬细胞溶酶体, 可进入机体补体系统并增强抗体活性, 从而杀灭有害微生物, 因此溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒都具有较强的抑制作用。
5 有关溶菌酶的最新研究进展
5 1 溶菌酶可以固定于一些包装纸上, 如湿墙纸和玻璃纸上, 应用于医院手术室及食品包装。如用提取的蛋清溶菌酶配制(2%~3%) 的酶液, 喷洒于包装纸上或将包装纸浸入酶液(2~3h) , 取出后在温度50~60 条件下烘干(酶活力基本不损失) , 用溶菌酶处理过的包装纸包装煮熟的大豆和新蒸的馒头, 结果在贮存近1周的时间内不变味; 而用普通纸包装的这些食品贮存1d 就会变味(常温下) 发黏
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。
5 2 采用固定化技术将溶菌酶固定在HEP A (空气过滤器) 上, 作为空调的空气净化系统, 使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时, 先滤集捕捉尘粒和细菌, 然后将捕捉到的细菌杀灭。
5 3 用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖, 使其成为能被人体吸收的、低分子量的、有独特的生理活性和功能性质的低聚壳聚糖。
5 4 海洋溶菌酶在化妆品中具有抑菌的作用。
目前, 国内对溶菌酶的研究虽然也取得了一些成果, 但由于起步较晚与发达国家之间仍有很大差距。溶菌酶的高端产品主要被美国、日本、加拿大等国公司垄断, 我国的溶菌酶只能作为粗品原料出口, 而且高端产品还要依赖进口, 这些事实严重阻碍了我国溶菌酶产业的发展。为了打破上述局面, 开发应用价值高, 具有自
Advances in the study of l ysozy m e
CHEN Y an , JI A NG M ing feng , YE H u hu, i LI U Yong tao , LI Sheng w ei
(Co llege o f L ife Sc i ence and T echnology , South w estU n i v ers it y for N ati ona liti es , Chengdu 610041, China)
Abstract :Lysozyme (LY) , virtually ub i qu itous t hroughout m icroorganis m , an m i al and p l ants , i s al ways consi dered to be a s m all
alkali p rotei n Lysoz ym e has l ong been used as amodel syste m for protei n struct ure , enz ym e k i neti c , molecu l ar m i munology and molecu lar evoluti on stud i es The i n f or mati on li ke source , structural co m positi on and properties , mechan i s m and them ethods of extracti on of l y sozy m e was i ntroduced i n this paper The app licati on of l ysozy m e i n f ood i ndustry , m edicine and enzy m atic engi neering in recent years w as su mmarized M ean w hil e , the prob le m s i nvol ved in the app licati on of lysozy m e w ere d i scussed i n detail s Furt her m ore , t he pros pect of l ysozy m e appli cation w as al so pred icted
Keywords :lysozym e ; bacteriostati cm echan i s m
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