南医生化实验报告2

生物化学实验报告

一、实验目的

1. 学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA 的原理、各试剂的作用及具体操作步骤； 2. 学习并掌握PCR 基因扩增的原理及具体操作步骤； 3. 学习并掌握紫外吸收法检测DNA 浓度与纯度的原理及方法； 4. 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。

二、实验原理

1. 质粒DNA 的提取——碱裂解法

在细菌细胞中，染色体DNA 以双螺旋结构存在，质粒DNA 以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA 和质粒DNA 均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH 值不同。在pH 高达12.6的碱性条件下，细菌的线性染色体DNA 氢键断裂。其中，双螺旋结构解开而变性；而质粒中超螺旋结构共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，线状染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起形成沉淀；而质粒DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，溶于上

清液。

2.PCR 基因扩增

PCR （Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA 序列。是指在DNA 聚合酶催化下，以DNA 为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA 片段得到特异性的扩增。具体步骤为：

（1）变性：加热使模板DNA 在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链；

（2）退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补结合； （3）延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，按5’→3’方向复制出互补DNA 。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。每经过一个循环，样本中的DNA 量应该增加一倍。

3. 紫外光吸收法定量检测质粒DNA

核酸的最大吸收波长为260nm ，蛋白质的最大吸收波长为280nm 。核酸分子对紫外光的吸收强度与溶液中核酸的浓度成正比，即光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。故可通过测定在260nm 和280nm 的A 值的比值（A 260/A280），估计核酸的纯度。

4. 酶切鉴定

限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列之内

或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA 。

5. 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，构成大网孔型凝胶。

不同的琼脂糖浓度对应不同孔径的凝胶，可用于分离、纯化相对分子量不同的DNA 分子。

DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同DNA 分子因其所带的电荷数、相对分子量大小和构象不同，在同一电场中的电泳速度也不同，从而从而分出不同的区带，达到分离的目的。

三、材料与方法： 1. 实验材料

（1）质粒DNA 的提取—碱裂解法

样品：菌液

试剂：LB 培养基（液体、固体）、溶液 P1（S1) 、溶液 P2 (S2）、溶液 P3（S3）、去蛋白液 PE（W1) 、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent)

仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅、Eppendorf 管、吸附柱、1.5ml 收集管、离心管

（2）PCR 基因扩增

样品：菌液

试剂：2×Premix Taq、引物1-SO100 (10mol/L)、引物2-SO101 (10mol/L)、灭菌的去离子水

仪器：加样枪、0.2mlPCR 反应管、台式离心机、基因扩增仪

（3）紫外光吸收法定量检测质粒DNA

样品：提取的质粒DNA 溶液 试剂：灭菌的去离子水

仪器：紫外分光光度计、UVette 比色皿、1.5mlEP 管、加样枪

（4）酶切鉴定

样品：菌液

试剂：灭菌的去离子水、10×R+BSA酶切缓冲液、质粒DNA 、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)

仪器：0.2ml 收集管、加样枪、台式离心机

（5）琼脂糖凝胶电泳

样品：质粒DNA 溶液、PCR 产物、酶切产物

试剂：6×loading buffer、电泳缓冲液、DNA Marker5000

仪器：加样枪、凝胶成像分析系统、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪

2. 实验流程

（1）质粒DNA 的提取—碱裂解法

（2）PCR 基因扩增

（3）紫外光吸收法定量检测质粒DNA

（4）酶切鉴定

（5）琼脂糖凝胶电泳

四、结果与讨论： 1. 实验结果

（1）紫外光吸收法定量检测质粒DNA 根据本次实验数据记得下表：

测定次数

1 2 3 平均值

A 260/A280 1.96 1.82 2.09 1.96

DNA 浓度（μg/ml）

34.8 36.9 31.8 34.5

经查阅资料可知：A 260/A280即Ratio 的数值有以下含义： 当Ratio= 1.8，则表示DNA 样品较纯, 符合实验要求；

当Ratio ＞1.9，则表示DNA 样品有RNA 污染；

当Ratio ＜1.6，则表示DNA 样品有蛋白质或其它杂质的污染。

而本人本次实验所测，Ratio=1.96＞1.9，所以本次提取的质粒DNA 有RNA 污染。 同时DNA 平均浓度为34.5μg/ml，表示本提取的质粒DNA 含量较低。

（2）琼脂糖凝胶电泳

本次实验琼脂糖凝胶电泳结果如下：

本次实验琼脂糖凝胶电泳预期结果如下：

经与预期实验结果对比：

实验中质粒DNA 的区带与预期实验结果中质粒DNA 的区带略有区别。预期实验结果中质粒DNA 有两个区带，表示其中一种片段长度在5000bp 以上，另一种片段长度在2000bp-3000bp 之间；而本次实验显示，质粒DNA 有三个区带，其中两种片段长度都在5000bp 以上，另一种片段长度在2000bp-3000bp 之间。

实验中酶切产物的区带与预期实验结果中酶切产物的区带不一致。预期实验结果中酶切产物有两个区带，分别为酶切长片段，长度在2000bp-3000bp 之间；含目的DNA 片段的酶切短片段，长度在250bp-500bp 之间。而本次实验显示，酶切产物仅一个区带，且长度大约为3000bp ，与酶切长片段长度基本一致；但含目的DNA 片段的酶切短片段区带缺失。

实验中PCR 产物的区带与预期实验结果中PCR 产物的区带相一致，仅一个区带，且PCR 产物的片段长度在250bp-500bp 之间。

2. 结果分析

本次实验结果显示：

（1）本次提取的质粒DNA 有RNA 污染且质粒DNA 的含量较低。

（2）质粒DNA 有三个区带，其中两种片段长度都在5000bp 以上，另一种片段长度在2000bp-3000bp 之间；酶切产物仅一个区带，且长度大约为3000bp ，与酶切长片段长度基本一致；但含目的DNA 片段的酶切短片段区带缺失；PCR 产物仅一个区带，且PCR 产物的片段长度在250bp-500bp 之间。

为此，经查阅资料与和同学讨论得以下影响因素及注意事项：

a. 加入250μl 溶液S1时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，不能有结块，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；

b. 加入250μl 溶液S2时，时间勿太久，轻轻颠倒4-6次，动作要温柔，不可剧烈震荡，避免把基因组DNA 剪切成碎片从而混杂在质粒中；

c. 加入350μl 溶液S3时，复性时间不宜过长，也不可以剧烈震荡；

d.EP 管与管盖相连的一侧最好朝向离心机的外侧，便于离心后吸取上清液，吸取上清液的时候注意不要碰到沉淀；

e. 在用70%乙醇洗涤质粒DNA 沉淀时，应尽量将乙醇挥发干净，因为残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定的时候，乙醇会使限制性内切酶失活；

f.菌液离心后除去上清液时，上清液应尽可能去除干净。为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部；

g.注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔；

h.DNA 区带不清晰，有可能是点样量少或过大，也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂等原因；

i. 为了消除RNA 的影响，可以在电泳前加入RNA 酶（约每10μlDNA 加1μlRNA 酶），37℃水浴30min ；

j. 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA 片段的电泳。

3. 讨论总结

（1）碱法提质粒中溶液I 、II 、III 的作用？

溶液I ：由50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris ·Cl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA (pH8.0)和Rnase 组成。作用是用葡萄糖悬浮细胞，EDTA 鳌合金属镁离子、钙离子使DNase 失活，也为溶菌酶的反应提供较低的离子强度的环境；

溶液II ：由0.2 mol/ L NaOH和1%SDS组成。作用是溶解细胞膜上的脂质和蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。还可以解聚细胞中的核蛋白。SDS 可以与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。

溶液III ：5mol/L 乙酸钠、冰乙酸和水组成。作用是使溶液的pH 调回中性，使变性的质粒DNA 能够复性并稳定存在。Na +可以中和DNA ，且钠盐可以与SDS-蛋白复合物作用，从而使变性蛋白-SDS 和线性DNA 沉淀。

（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？

a. 若在DNA 样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA 、SDS 和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。所以应该提高DNA 的浓度，尽量将其中的蛋白质除尽；

b. 不同限制性核酸内切酶对NaCl 浓度的要求不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可以先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA ，然后补足适量的NaCl ，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；

c.DNA 分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA 比消化线性DNA 用酶量要高出许多倍，可以改变DNA 的构象，使其简单化。有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异；

d. 实验中要有适宜的温度，多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。