露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质
第27卷第3期
2008年5月
食品与生物技术学报
V ol. 27 N o. 3M ay. 2008
文章编号:1673 1689(2008) 03 0104 05
露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质
刘友勋, 马富英, 熊征, 颜克亮, 吴航军, 张晓昱*
(华中科技大学生命科学与技术学院, 湖北武汉430074)
摘 要:露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow 和Sephadex G 100纯化, 得到纯化152. 54倍胆红素氧化酶, 得率19. 14%; 用PA GE 检测为单一条
带, 活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶, SDS PA GE 证明该酶的相对分子质量为64000。该酶最适反应温度为55 , 以胆红素为底物时最适pH 值为7 5, 而以ABTS 为底物时最适pH 值为4, 该酶在pH 3~8之间都能够检测到酶活。以胆红素为底物, 胆红素氧化酶的K m 值和V max 分别为552 06 m ol/L 和38 91 mol/(L min) ; 而以ABT SA 为底物, 胆红素氧化酶的K m 值和V max 分别为631 84 m ol/L 和12 79 m ol/(L min) 。关键词:露湿漆斑菌; 胆红素氧化酶; 纯化; 性质中图分类号:Q 556
文献标识码:A
Purification and Characterization of Bilirubin Oxidase
from My rothecim roridum
LIU You x un, M A Fu y ing, XION G Zheng, YAN Ke liang,
WU H ang jun, ZH AN G Xiao y u
*
(Schoo l of L ife Science and T echno log y, Huazho ng U niver sity of Science and T echnolog y, W uhan 430074, China)
Abstract:Bilir ubin ox idase fr om M y rothecim r oridum w as purified to electrophor etic hom ogeneity by the steps o f am monium sulfate precipitation, DEAE Sepharo se Fast Flow and Sephadex G 100co lum n chrom ato graphy. Purificatio n of about 152. 54fold w as achieved w ith an ov erall y ield o f 19. 14%.It w as demonstrated to be bilirubin oxidase by nativ e PAGE, and its molecular w eig ht w as estimated to be about 64000by SDS PAGE. T he o ptimum temperature o f the enzym e activity w as 55 . T he optimum pH fo r bilirubin and ABT S w er e 7 5and 4, respectively. T he K m fo r bilirubin and ABT S w as 552 06 mo l/L and 631 84 m ol/L, respectively. In addition, T he V max for bilir ubin and ABT S w as 38 91 m ol/(L min) and 12 79 m ol/(L min ) , respectiv ely.
Key words:M y rothecim ror id um ; bilirubin ox idase; purification; proper ties
胆红素(Bilirubin) 是一类线形四吡咯衍生物, 是血红素在人体内的代谢产物之一。胆红素在人
收稿日期:2007 06 21.
体内生成过多或肝细胞对胆红素的摄取结合排泄过程发生障碍, 都可使血液中胆红素浓度增高而出
作者简介:刘友勋(1976 ) , 男, 湖北鄂州人, 生物化学与分子生物学博士研究生。
*通讯作者:张晓昱(1957 ) , 男, 湖北恩施人, 工学博士, 教授, 博士生导师, 主要从事微生物学与生物技术方面的
研究. Ema il:zhangx iao yu@mail. hust. edu. cn
第3期刘友勋等:露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质
1. 4 酶活力的测定
105
现高胆红素血症[1]。所以, 测定血中胆红素水平对临床诊断肝胆疾病、溶血等有着重要的意义。胆红素氧化酶(Bilirubin ox idase, BOD) 是一种含铜的多酚氧化酶, 能催化胆红素氧化, 氧气是其电子受体。反应过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素, 后者进一步氧化最终生成性质还不清楚的无色化合物
[1-3]
ABT S 法:在3m L 反应体系中, 含有2 7m L pH 4 5、0 2m ol/L 的乙酸 乙酸钠缓冲液, 0 1m L 酶液, 0 2mL 1mm ol/L 的ABTS, 按次序混合并摇匀, 30s 后开始记录A 420, 每隔15s 记录一个A 420值。一个酶活力单位(U ) :在上述条件下, 每分钟催化1 mol ABT S 氧化所需的酶量。
胆红素法:参照文献[3, 7]。1 5 蛋白质质量分数测定
按Low ry 法[10]测定, 以牛血清白蛋白作标准。1 6 电泳
SDS PAGE 见文献[10]。分离胶质量浓度为10g/dL, SDS PAGE 用考马斯亮蓝R250, 摇床染色2h; PAGE 活性染色按文献[11]略加修改, 使用底物分别为ABT S 和胆红素。1 7 酶的分离与纯化
1 7 1 硫酸铵盐析、透析 菌种在28 下、PDB 培养基中摇瓶培养5d 后, 经8层纱布过滤, 6000r/m in 离心20m in, 所得上清液冷冻过夜, 解冻除去沉淀, 上清液即为粗酶液。80%饱和度硫酸铵沉淀, 4 静置过夜。10000r/min 离心20min, 弃去上清液, 沉淀溶解于蒸馏水中, 对其透析过夜。1 7 2 DEAE Sepharo se Fast Flow 柱层析 将上述所得酶液加到已用0 01mol/L 磷酸钠缓冲液(PBS 7 0) 平衡过的DEAE Sepharo se Fast Flo w 柱(1 8cm 20cm ) , 先用PBS 洗柱, 后改用含0~0 5mo l/L N aCl 的PBS 梯度洗脱, 合并有酶活组分, 将所得溶液冷冻干燥成粉。1 7 3 Sephadex G 100柱层析 将上述所得活力组分的冻干粉溶解于3mL 蒸馏水中, 所得酶液加到平衡好的层析柱(2 0cm 80cm ) 上, 用上述缓冲液洗脱, 收集活力较高的组分, 并将其冻干, 溶解在2m L 的蒸馏水中, -20 下保存。
1 8 酶学性质1 8 1 表观相对分子质量测定 SDS PA GE 法测定漆酶的相对分子质量, 根据已知相对分子质量的标准蛋白质在SDS PAGE 中的相对迁移率R f , 作R f lg M r 图, 求得其相对分子质量。
1 8 2 最适反应温度 先将加有底物的反应缓冲液在不同温度下保温15min, 然后在测试之前加入酶液, 按酶活测试法测其活力。
1 8 3 酶的最适反应pH 值 将胆红素分别溶于pH 3 0~8 0的磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液中, 用于测酶活力, 或在pH 3 0~8 0的磷酸氢二钠 柠。自从1981年日本学者发现漆斑菌属能
高产胆红素氧化酶后, 临床医学中开始使用酶法来测定胆红素, 该方法具有特异灵敏和操作简便等优点, 适用于临床手工或自动化测定。由于胆红素氧化酶和漆酶具有类似的性质, 近年来, 胆红素氧化酶的应用逐渐拓宽, 被用于生物电池的制造、纺织行业的布料脱色、环境废水的处理等方面的研究
[4-6]
[3]
, 但是国内对于BOD 的生化性质研究报道较
少。
Murao 等在研究BOD 方面做了大量工作。他们通过深层培养, 比较了M yr othecium 属不同菌株的产酶能力, 并分离得到一株疣孢漆斑菌(M y roth ecim v err ucar ia) , 其产酶能力高达19U /mL, 而同属不同种的菌株还不到1U/m L 。张淑贤在筛选产BOD 的微生物时, 发现一株高产BOD 的露湿漆斑菌(My r othecim r oridum ) , 但其酶产量为l. 3U /mL
[8]
[7]
。不同菌株的疣孢漆斑菌的BOD 已被分离
纯化, 但所报道的回收率不一样, 王菊君从疣孢漆斑菌纯化出BOD 的得率为23%左右, 而M urao 纯化出BOD 的得率为17%左右
[7-9]
。
作者从土壤中筛选到一株高产BOD 的露湿漆斑菌, 其酶产量可达到5U /mL 左右。对该菌产生的BOD 进行了分离纯化, 对胆红素氧化酶性质进行初步研究, 为该酶的应用打下了良好的基础。
1 材料与方法
1. 1 菌种
该菌从土壤中分离得到, 经分子生物学鉴定和显微观察为露湿漆斑菌(GenBank 中的编号为EF458487) 。
1. 2 主要生化试剂
2, 2 连氮 双 (3 乙基苯并噻吡咯啉 6 磺酸) (ABT S) , 美国Sigm a 公司产品; DEAE Sepharose Fast Flow 和Sephadex G100填料, 美国GE H ealthcare Bioscience 产品。其它生化试剂均为国产分析纯试剂。1. 3 培养基
PDB:200g 去皮土豆, 20g 葡萄糖, 1000mL
106食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷
条蛋白质带, 见图1。表明纯化后的蛋白质为单一组分, 已达到电泳纯。酶样品经活性电泳后, 将凝胶切成两块, 一块以A BT S 为底物, 在pH 4 5醋酸缓冲液中进行活性染色, 30m in 后显示出单一的绿色条带, 见图2中泳道1; 另一块凝胶以胆红素为底物, 在pH 8 0的H Cl Tr is 缓冲液中进行活性染色, 胆红素溶液先将凝胶染成黄色, 大约2h 后在黄色的背景下呈现出一条浅绿色的条带, 见图2中泳道2。这些结果表明纯化得到单一蛋白质组分为胆红素氧化酶。
1 8 4 动力学常数测定 在不同底物(ABTS 、胆红素) 浓度的反应体系中, 计算酶反应的初速度, 作Linew eaver Burk 双倒数图。
2 结果与分析
2 1 胆红素氧化酶的分离与纯化
胆红素氧化酶的分离与纯化结果见表1。粗酶液经80g /dL 硫酸铵盐析、DEAE Sepharose F F 柱层析和Sephadex G 100柱层析后所得样品比活力为106 77, 纯化倍数为152 54, 活力回收率为19 14%。该酶样品经SDS PAGE 检测只显示一
表1 胆红素氧化酶的纯化总表
Tab. 1 A summary of bilirubin oxidase purification
纯化
步骤粗酶
80%(N H 4) 2SO 4沉淀DEAE Sephar ose F. F Sephadex G 100
酶总
活力/U 1540. 981467. 25856. 30280. 82
总蛋白质质量/mg 2201. 23320. 3440. 232. 63
酶比活力/(U /mg )
0. 74. 58421. 28106. 77
纯化倍数-6. 5530. 4152. 54
回收率/%10095. 2155. 5719.
14
2 2 胆红素氧化酶的部分酶学性质
2 2 1 相对分子质量 由SDS PAGE 电泳图, 得到相对迁移率与胆红素氧化酶相对分子质量(M r ) 的关系, 从图1可以看出, 胆红素氧化酶相对分子质量大约为64000(从上往下的5条带相对分子质量M r 分别为97400、66200、43000、31000、20000) 。2 2 2 最适反应温度 以ABT S 为底物在pH 4 5的缓冲液中测其在不同温度下的酶活。从图3
1, 纯化的蛋白质组分; M , 相对分子质量M ak er
图1 BOD 的SDS PAGE 图Fig. 1 SDS PAGE of
BOD
可以看出, 在10~55 之间, 随着温度的上升, 酶活也在提高, 55 时达到最高, 超过55 时酶活开始下降, 到70 时BOD 几乎完全失活。实验结果表明, 酶的最适反应温度为55 左右。
图3 温度对BOD 活性的影响
Fig. 3 Effect of temperature on the activity of BOD
1. 与ABT S 活性反应; 2. 与胆红素活性反应
图2 BOD 的活性PAGE 图
2of 2 2 3 最适反应pH 值 如图4所示, 在28 2
~8下的酶活。在有氧的条件下, BOD 能将胆红素氧化成绿色的胆绿素或者进一步生成无色物质。以胆红素为底物时, 在pH 2~4之间, 基本上测不到酶活, 而在pH 4~7 5之间酶活逐渐上升, pH 值超过7 5之后, 酶活迅速下降, 所以BOD 催化胆红素氧化的最适pH 值在7 5左右。另外, BOD 也能将ABT S 氧化成绿色ABTS 。当以ABTS 为底物时, 在pH 2~4之间, 其酶活逐渐上升, 而pH 超过4时其酶活逐渐下降, 所以BOD 催化A BT S 值氧化的最适pH 值在4左右。这些结果表明, 酶催化反应的最适pH 值是相对而言, 催化不同的底物有不同的最适pH 值。BOD 适合在偏酸性的条件下和ABTS 反应, 而在中性偏碱性的条件下适合和胆红素反应。
+2
图6 双倒数法测BOD 的K m ABTS Fig. 6 Double reciprocal plot of K m A BTS
3 结 语
BOD 和漆酶都属于多铜离子氧化酶, 又称为多酚氧化酶, 二者之间有许多交叉底物, 例如ABT S 、丁香醛连氮、愈创木酚, 但二者之间的区别在于BOD 能专一性地氧化胆红素, 而漆酶不能催化胆红素的氧化, 其最适底物为ABT S 。作者通过研究BOD 的K m 证实了胆红素是BOD 的最适底物。漆酶是一种用途非常广泛的酶, 但由于其酶活作用范围偏酸性, 对其应用受到了一定的限制[12]。而BOD 和漆酶属于同一家族, 有许多类似的性质, 其在中性范围内有很好的催化活性, 因此受到广大科学工作者的关注, 使BOD 从医学应用领域逐渐转移到其它领域, 例如生物电池等[6]。露湿漆斑菌是一种高产BOD 的真菌, 作者从该菌的土豆发酵液中分离纯化得到单一的蛋白质组分, 将该蛋白质进行活性电泳后, 用底物ABTS 和胆红素的溶液浸泡凝胶, 活性染色结果表明, 纯化的蛋白质是BOD, 而且未发现有同工酶。王菊君从疣孢漆斑菌纯化出一种相对分子质量为54000的胆红素氧化酶[9], 而作者纯化的BOD 相对分子质量为64000比其要大, 这可能是由于两个菌种之间的差异造成。胆红素是BOD 的专一底物, 其常用于BOD 的酶活测定。但胆红素的溶液不稳定, 容易发生自氧化, 一般只能保存3d, 这给BOD 的酶活测定带来不准确性。ABTS 虽然不是BOD 的最适底物, 但其和BOD 反应迅速, 生成绿色的ABT S 在420nm 处有特定的吸收峰, 易于测定, 而且ABT S 溶液比较稳定, 在4 下可以保存1个月。因此, 相比较而言, 用ABT S 作为测定BOD 酶活的底物是一个很好的选择。不论是以胆红素还是以ABT S 为底物时, BOD 在pH 3之前未测到活性, 而在pH 3~8
+2
[1]
图4 pH 值对BOD 活性的影响Fig. 4 Eff ect of pH on the activity of BOD
2 2 4 酶的K m 值和V max 以Linew eaver Bur k 作图(见图5, 6) 。以胆红素为底物, 在pH 7 5时, BOD 的K m 值和V max 分别为552 06 mol/L 和38 91 m ol/(L min) ; 而以ABT S 为底物, 在pH 4 0时BOD 的K m 值和V max 分别为631 84 mol/L 和12 79 m ol/(L min) 。由此可见, BOD 与胆红素的亲和力比与ABT S 的亲和力大, 与胆红素最大反应速率也比与ABT S 最大反应速率大, 这一结果证明了胆红素是BOD
的最适底物。
图5 双倒数法测BOD 的K m 胆红素
之间都能够测到酶活, 这表明BOD 在比较宽的pH 值范围下有催化活性, 这一结果也预示着BOD 具有较大的工业应用价值, 其它相关的酶学性质还在进一步研究之中。
Fig. 5 Double reciprocal plot of K m b ilir u b in
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(责任编辑:李春丽)