含铜抗菌不锈钢的抗菌特性研究
第43卷
2007年lO月第10期第1065--1070页金属孝厦ACTAMETALLURGICASINICAVot.43Oct.2007No.10PP.1065—1070
含铜抗菌不锈钢的抗菌特性研究
南黎,,。)刘永前t,a)杨伟超z,。)±徐慧。)李瑛-)吕曼棋-)杨柯,)
1)中国科学院金属研究所,沈阳110016
2)中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016
3)中国科学院研究生院,北京100049
摘要研究了铁索体和奥氏体寄铜抗菌不锈锕的抗茁特性及相关机制,实验结果表明,古铜抗苗不错钢具有优良的广谱杀菌
作用,对本文选择的大部分革兰氏阴性苗(G一)和革兰氏阳性菌(G+)的杀灭率均在99o%阱上.通过铁累体抗苗不锈钢对大
肠杆菌作用不同时间的研究证明,抗菌不锈钢的杀苗率和其与细菌作用时间有关,铁索体抗菌不锈钢与大肠杆菌作甩150min左右时间后的杀菌率才会达到99.9%的最大值原子力显徽镜的舰察表明.抗菌不锈钢对大肠杆菌的杀灭表现为菌体内大量物质流
失.细菌出现干瘪现象电化学实验结果表明,抗苗不锈钢与大肠杆菌作用后。会由于其表面抗苗相中铜离子溶出的加快。而表现
为其耐点蚀电位的下降
关键词抗曹不镑钢,抗菌特性.杀菌率,大肠杆苗
中图法分类号TGl42,TGl72,TGl42.71文献标识码A文章编号0412—1961(2007)10—1065-06
STUDYoNANTIBACTERIALPRoPERTIESoFCoPPER—
CoNTAININGANTIBACTERIALSTAINLESS
ⅣAⅣ三il,3l,LIUYongqianl,31,yHⅣGⅣ吼c丘Ⅱ02,∞,XU胁‘产),LJYingD,工U
11InstituteofSTEELSManqi¨,yAⅣG讹1)MetalResearch.ChineseAcademyofSciences.8henyang110016
1100162)InstituteofAppliedEcology,ChineseAcademyofSciences,Shenyang
3)GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049
Correspondent:yHⅣG
Supportedby
MantmcriptNotionalreceivedNaturalScienceFoundationofKe,professor,丁kz:(oe圳霉3971628,E-mail:kyang@imr.ac.c讥China(No5067110i}2007-02—Ol
Theantibacterialpropertiesandrelerantmechanismofcopperlcontainingferritic
andansteniticantibacterialstainlesssteelshavebeenstudied.ExperimentalresHltsdisplayedthattheABSTRACT
copper-containingantibacterialstainlesssteelshavethebroadspectrumantibacterialfeatures,and
them】tibacterialrateagainstmostoftheGram—negativebacteriaandGram-positivebacteriaselected
thepresentworkreachedabove99O%.ThroughstudiesonthedifierentactiontimesofE.coti
inCOntactwithferriticantibacterialstainlesssteel,itwasprovedthattheantibacterialrateofaninantibacterialstainleSSsteelshouldberelatedtotheactiontime,andtheantibacterialratereached
99.9%ordYwhenthesteelCOntactedwiththebacteriaforabout150nfin.TheAFMobservation
indicatedthattheantibacterialmechani8111oftheantibacterialstainlesssteelsshou】dbeattributed
ofthematerialsandshrivelingofthecellsinthebacteria.Theelectrochemieal
experimentsshowedthataftercontactingwithEcoli,theprecipitationofCUionsonthesurfaceofantibacterialstainlesssteelsbecamefaster,resultinginadecreaseofthepittingpotentialofthesteel.tomoreleakingout
KEYWoRDSantibacterialstainlesssteel,antibacterialproperties,antibacterialrate,
Escherichiacoli
在地球环境中,微生物无处不在11-a】环境微生物感染事件,曾一度引起拿世界的恐慌141,2003年5月在
美国中西部爆发的猴痘病毒等,都是近年来出现的新型病
毒H.同时,环境微生物还能在各种材料包括金属表面形
成生物膜,导致材料的腐蚀破坏.近年来,由微生物及其
变种引发的全球性微生物灾害事件已多次发生,严重影响
了人类正常的社会活动并给经济发展带来极大隐患[6-sJ.因此,寻找和开发各种有效的抗苗剂和抗菌材料【”“j,以诸如细菌、真菌和病毒,会导致人们感染多种疾病.例如1996年在日本发牛了全国范围的病原性大肠杆菌0157+国家自然科学基金资助项目50671101收稿日期:2007_02_01作者简介:南黎,女,1981年生.博士生
金属学报第43卷
减轻微生物的附着和可能的感染,在公共环境健康和安全
日益受到人们重视的今天,具有重要意义.
含铜抗菌不锈钢[13,14】由于具有优良的抗菌活性,逐
渐在越来越多的领域中得到应用,然而仍有许多相关的基
础性研究工作需要深入进行.本文在已有研究的基础上,
通过对含铜抗菌不锈钢的广谱杀菌性、抗菌动力学等抗菌
特性方面进行进一步研究并探讨其相关机理,为抗菌不锈
钢的更为广泛应用提供依据.
1实验方法
1.1实验材料
本研究中使用由中国科学院金属研究所研制开发的
含铜奥氏体抗菌不锈钢(0Crl8Ni9—3.S%Cu)和含铜
铁素俸抗菌不锈钢(0Crl7-1.8%Cu),对照样品分别为
0CrlSNi9奥氏体不锈钢和0Crl7铁索体不锈钢.实验用
材料样品均从相应的不锈钢薄板上裁取,尺寸为40mm
×40mill×1mm.
实验用大肠杆菌(EscherichiaCOEE.coO
ATCC25922由中国药品生物制品检定所提供,其余菌
种由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供,分别为表皮
葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)ATCCl4990、
藤黄八叠球菌(Sarcinalute曲ATCC9341一A,粘质沙
雷氏菌(Serratiamarcescens)ATCC8100、短小芽孢
杆菌(Bacilluspumilus)ATCCl4884,弗氏志贺氏菌
(Shigellafexneri)ATCCl2022、铜绿假单孢菌(Pseu・
domonasaeruginosa)ATCC9721、粪肠球菌(Entero—
COCC∞如ecalis)ATCC29212.由于这些菌种都是日常生
活中的常见细菌,对人体和环境有一定危害,因此本研究
采用这些菌种作为实验菌种来考察抗菌不锈钢的杀菌性
能.
1.2实验方法
1.2,1抗茵性能实验抗菌实验采用覆膜法来评价
抗菌不锈钢的杀菌性能,该法是国内外目前常用的固体材
料抗菌性能检测方法之一,能定量地检测抗菌材料的杀菌
率【“I.实验中,各种菌液的初始浓度均为106cfu/mL,
每种抗菌实验重复3次.通过将该浓度的菌液均匀滴加到
样品表面,再覆盖无菌塑料薄膜,使菌液与样品表面充分
接触,然后在37℃的培养箱中培养24h,最后计算样品
的杀菌率.杀菌率(K)的计箅公式为
K:—l’—coIntf--—2一Vanti×100%』Vcont
式中,Ⅳ。。nt为对照不锈钢活菌数,等于对照不锈钢表面
细菌培养实验后的菌落数;Ⅳauti为抗苗不锈钢活菌数,
等于抗菌不锈钢表面细菌培养实验后的菌落数.实验中采
用的完全培养基的组成如下:牛肉膏5,0g,氯化钠5.0g,
蛋白栋10.0g,自来水1000mL,pH值为7.0—7.2,
根据相关文献报道115J,空气环境中的微生物浓度
为(1—104)cfll/L,水中的微生物浓度为(1—104)cfu/mL.根据国家相关标准规定。儿童房中的室内环境细苗总数<10cfu/m3;罐装矿泉水中的微生物总数<50cfu/mL[”J;瓶(桶)装饮用纯净水中菌落总数S20cfu/mL,大肠苗群≤3cfu/loomLI”J.因而以上细菌浓度要求均远小于本实验所选菌液浓度.中国抗莆材料及制品行业协会对抗菌制品具有抗荫性的标准规定为抗菌率大于90%即认为该制品具有抗菌性能.1.2.2细菌彤挽观察与其它常规^t微手段相比,原子力显微镜(AFM)具有分辨率高,放大倍率连续可调,探测过程中对样品表面无摄伤,不舞要高真空工作条件,且体积小、成本低等明显优势【18J,已在材料研究中得到广泛应用.本文采用PICO。SCAN2500型原子力显微镜来观察细菌与抗菌不锈钢接触不同时间后的形貌变化.将样品制成10mnl×10mm×10mill的立方体,选择不同型号的SiC砂纸在预磨机上将其逐级研磨,然后分别用2.5、1.5和0.5“m的研磨膏抛光.抗菌实验仍然采用覆膜法,选择初始浓度为106cfu/mL的大肠杆菌ATcC25922作为实验菌种.1.2,3电化学实验抗菌不锈钢表面与细菌作用后,萁电化学行为应会发生一定程度的变化.通过对抗菌不锈钢与大肠杆菌作用前后的电化学性能进行测试,可为抗菌不锈钢的抗菌特性深入研究提供一定有价值的信息.将抗菌不锈钢剪成10ltlXT/×10mm的薄片样品,然后将样品洗净,去脂,再用环氧树脂馀封其中一个表面,另一面留做实验.首先采用覆膜法将浓度为106cfu/mL的大肠杆菌苗液均匀滴加到抗菌不锈钢的表面,用无菌塑料薄膜覆盖,在37℃培养箱中培养24h后,立刻进行电化学性能测试.对照样为不与大肠杆菌作用的抗菌不锈钢样品,采用常规电化学三电极系统方法在CHl660A工作站上对样品进行极化曲线测试,参考电极为KCl饱和甘汞电极,对电极为铂电极,扫描速度为0.5mV/s.测试前在金相预磨机上将样品逐级研磨至400号砂纸,电解质为8.5‰的NaCl生理盐水溶液,实验温度为25℃,各环境因素均与抗菌实验的条件保持一致,实验样品未经钝化处理.2实验结果与讨论2.1抗菌不锈钢的抗菌谱表1和表2中列出的抗菌性能实验结果表明,两种含铜抗菌不锈钢都表现出良好的抗菌性能,对本研究选择的8种常见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀灭率均在90%以上,表现出良好的广谱抗菌性能.图1和图2分别直观地示出了典型革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌经过抗菌性能实验后的菌落数量变化情况.可以看出抗菌不锈钢与菌液作用24h后,菌落数均大幅度减少,甚至在肉
~第10期南黎等:含铜抗菌不锈钢的抗菌特性研究
衰1
of1067抗菌不锈钢对革兰氏阳性苗的抗苗谱Table1Antibacterialspectrumthea_ⅡtibacterialstainlesssteelsagainsttheGram-positivebacteria
&qhlococeu.sepidermisATCCl4990
ATCC9341A99.999.999.9&rc{¨Ⅱ轧teu999
Serra“a”tdr优soB瑚ATCC8100
B∽dhⅡpumi札sATCCl488498.299.5024
93697.7.眈£竹1Dcocc“8如eca/is
steelsATCC292129100Note:coInLamarctheCorrespondingsteelswithoutelementCu
衰2抗菌不锈钢对革兰氏阴性菌的抗菌谱
ofTable2AntibacterialspectrumtheantibacterialstainlesssteelsagainsttheGram-negativebacteria
ExperimentalbacteriaAntibacterialrate.%
FerriticantibacteriaIAusteniticantibacterial
stainless
99.9steelContfaststainlesssteelEzcherichiacoilATCC2592299.9
990
999steel0Sh咖lla^:menATCCl2022Pseudomonas99.599900ae他gmosaATCC9弛I
田1抗菌实验后短小芽孢杆菌落照片(革兰氏阳性菌)
Fig.1Phot080fthecultureplaoesalterantibacterialtest
against
trast
teria
ingBacillus圈2抗菌实验后弗氏志贺氏苗落照片(革兰氏阴性苗)Fig.2Photosoftheagainsttrastteria0118cultureplaresai%er柚tjb越terhlte虻24purnilus【G+)for24h(1eft:coil-antibac-Sh姆ella扛xneri(G一)forh(1eft:con-antibac,steel(0Crl8Ni9),middle:austeniticthetwoantibacterlalsteelssteel(0CrlgNi9),middie:austcniticsteel,right:ferriticantibacterialcansteelfright:ferriticantibacterialsteel)1show-lmveobvious日,lq-steel),obvi-antibacterialeffectbe8een
tibacterialeffect
眼下观察不到.但相对比较而言,抗菌不锈钢对革兰氏阴
性菌有更大的杀灭作用,如抗菌不锈钢对大肠杆菌的杀菌
率在99.9%以上,而对粪肠球菌的杀菌率不到95.0%.据
相关文献报道[19--20】,铜离子与细菌作用的抗菌机理由两
个步骤组成:首先是从材科表面溢出的铜离子被吸附到细
菌细胞的表面;然后是铜离子破坏了细菌的细胞膜,导致
蛋白质凝固.因此,铜离子能否渗入到细胞膜内是至关重要的.革兰氏阴性菌细胞壁的厚度是lO一15Ⅱm+而革兰氏阳性菌细胞壁的厚度是20一80nm,所以铜离子应该更容易进入到革兰氏阴性菌细胞内部而杀死细茵.2.2杀菌率随时间的变化图3示出了铁素体抗菌不锈锕对大肠杆菌的杀菌率随材料与细菌作用时间的变化,可以看出抗菌不锈钢的杀
菌率是随作用时间而变化的.随着作用时间的增加,其对
金属学报
大肠杆菌的杀菌率逐渐增加,当作用时间约为150min
时,达到r99.9%以上的最大杀菌能力.这可能是冈为第43卷抗菌相中的Cu离子溶出达到最大值,相应杀菌率也达到最大值,从而使抗菌不锈钢表现出最优的抗菌性能.
2.3在对人肠杆菌的作用初期,抗菌不锈钢表面上的抗菌相中
Cu离于的溶出还很少,表现出的杀菌作用还不明显,只细菌的形貌变化分析从图4示H{的AFM图像中可以看到,与铁素体抗是通过抑制细菌的生长繁殖,使抗菌币锈钢表现出一定的
抗菌活性;随着作用时间的延长,抗菌不锈钢表面抗菌相
中的Cu离子溶出逐渐增多,其与细菌的作用会逐渐增
强,杀菌率逐渐增高,至150rain左右,抗菌不锈钢表面菌不锈钢开始作用时,正常人肠杆菌的外形呈短棒状,边缘整齐,细胞壁缔构紧密、完整且没有间隙;大肠杆菌与抗菌不锈钢作用1h后,细胞壁出现扭曲变形,细胞内有少量物质漏H{,结构开始不完整;作用2h后,细胞外膜
更加模糊不清,内容物严重流失,胞浆内出现透电子区,
甚至有的荫体出现干瘪现象;当作用3h后,内容物全部
流失,菌体完全l’瘪,此时抗菌不锈钢的杀菌率亦达到了
最大值.
根据相关文献报道19】,存铁素体抗苗不锈钢的抗菌
过程中,大肠杆菌明显呈现出逐渐消瘦的趋势,菌体内大
量的组织液流失.本文通过原子力届微镜下的观察可以证
明,正常的人肠杆I宥应该表现出细咆孽结构完整,胞浆内
梭质区明显.随其与抗菌不锈钢作用时间的延长,细胞壁
开始肿胀,疏松,细胞壁和细胞膜的结构受到了破坏,细
胞内物质如核厦,蛋白质等开始漏出,直到细胞壁和细胞
圈3铁索体抗菌不锈钢对大肠杆菌的杀菌率随作用时间的变化
Fig.3Variationof
theactionantibacterialrateagainstfor膜完全破裂这一实验结果表明,抗茼不锈钢与大肠杆菌作用后,通过破坏其屏障细胞壁和细胞膜的保护作甩,使细胞的通透性增加,内容物流出而使细胞死亡,但抗菌不
锈钢究竟作用于细菌细胞壁或细胞膜的哪些成分,有待于
进一步的研究E.∞“withstainlessofCuiontimeferriticantihacterialsteel.meaningtheincreasedwithprecipitationamountactiontimeincreasing
圉4铁索体抗苗不锈钢与大肠杆菌作用小同时间后的表面AFM图像
Fig.4.AFMimagesoftheBurfarceofferriticantibacterialstainlesssteelactedwithEco/ifordifferenttimes
(a)beginning
(b)actionfor
ec)actionofaction,short1h,ceilwallrodlikeE.coilandahasperfectofmorphologyoutbecteriashriveleddeformedinfewmaterialsincellleakedsomefor2h,materialscellleakedoutand
(d)actionfor3h.allbacteria
shriveled
第10期南黎等:舍铜抗菌不锈钢的抗菌特性研究
2.4抗菌不锈钢与细菌作用前后的电化学行为
图5和图6分别为铁素体抗菌不锈锕和奥氏体抗菌
不锈钢与大肠杆菌作用前后的电化学极化曲线.跌圈中可
以看出,与大肠杆菌作用24h后的抗菌不锈钢的点蚀电
位均有所下降,但钝化电位略有升高.抗菌不锈钢点蚀电
位的降低表明其耐局部腐蚀能力的下降,这应与抗菌不锈
锕表面存在的富Cu抗菌相与细菌的柑互作用有关,抗菌
不锈钢表面与细菌液接触后,表面上的富Cu相中部分溶
出的Cu离子会与细菌作用【“J,进而造成大量细菌的死
亡,即抗苗不锈钢表现出强烈的杀灭细菌效应.然而Cu
离子与细菌的这种交互作用势必会增大富Cu抗苗相表
面的活性,从而进一步加速了Cu离f的溶出速率,使富
Cu相与基体之间更易形成徽电池结构,促进了局部腐蚀
(点腐蚀)的发生.抗菌不锈钢与大肠杆菌作用前后的电化
围5铁索体抗菌不锈钢与大肠杆菌作用前后的概化曲线
Fig.5PolarizationcllrveBofferriticantibacterialstain-
leassteelbefore(curve1)andafter(ctlrve2)action
withEco/ifor24h
图8奥氏俸抗菌不锈钢与大肠杆菌作用前后的板化曲线
Fig.BPolarizationcurvesofaustiniticantibacterial
stainlesssteelbefore(cur"1)andafter(curve2)
actionwithE.eo/ifor24h
学行为变化进一步证明,抗菌不锈钢中Cu的加入以及Cu离于在钢表面的溶出,是不锈锕具备抗菌性能的关键所祀3结论(1)含铜抗菌不锈钢具有良好的广谱抗菌性能,对大部分革兰氏阴性菌和革兰氏}轲性菌均表现出很强的杀菌作用,杀菌率都在99.O%以上.(2)抗菌不锈钢的杀菌率和其与细菌作用时间有关,铁索体抗菌不锈钢与大肠杆菌作用150min左右后,杀菌率才会达到999%的最大值,(3)大肠杆菌与抗菌不锈钢作用后,其细胞壁会由完整逐渐变为模糊不清,细胞内物质大量漏冉,导致细胞重度扭曲变形,荫体最后干瘪.(4)抗菌不锈钢与大肠杆菌作用后,会由于其表面抗菌相中铜离子溶出的加快,而表现为耐点蚀电位的下降,参考文献[1】CaoFQ,KongL,"fangSL.JChinaTodayMOd,2003;3(13):91(曹芳芹,孙琳,杨胜利.中华今日医学杂志,2003;3(13):91)【21LuDYMedicalMicrobiology.5ed,Bering:PeopleSan-itationPublishing,2001:28(陆德源.医学微生物学第5版,北京:人民卫生出版社,2001:281【3】EllisGP,LuscombcDK.ProyMedChem,1994;81:351[4]WuXH,"fangLF,WangYD,ZhaoJC.J毹Inter-nationalExhibitionofChinaAntibacterialproducts,2ndDevelopingConferenceofChinaAntibacteTiatMaterialaIndustries.Beijing,2002:235(吴兴惠.杨留方,王毓德,赵景畅.见:中国首届抗菌制品(材料)国际展览会,第二届中国抗菌材料产业发展大会。北京,2002:2:辑、【51ShiKHighSeminarofChinesePublicSanitationCon一¥truction,Beljing:NationalHealthIndustryBusineesManagementAssociationl2004:148(时勘.见中国公共卫生建设高屡研讨会,北京,全国卫生产业企业管理协会,2004:148)嘲Wanyz.WamgYL,ChengGx,1‰KD,TaoHM,XinJY,WenTY.Mater&2Eng,1998;16(4):2(万怡灶.王五林,成圊祥,姚康德,陶海明,辛景义.温廷益材料科学与T程,1998;16(4):2)【7】ZhongFL,CaoHB,LiXG.Mater‘2000;14(8):43(钟方丽.曹宏斌.李矗钢材料导撤,2000;14(8)43)【8j8WrightJB,LamK,BurreURE.AmJInfectCone.or,1998;26:57219IChenSH.P^DDissertation,InstituteofMetalResearch。ChineseAcademyofSciences,Shenyang,2004(陈四红中国科学院金属研究所博士学位论文,沈阳,2004)【10】GhenSH,LdMQ,ZhangJD,DongJS,YangK.ActaMetalls”1.204)4;40:314(陈四红,吕堑祺,张敬党。董加胜.扬柯.金属学报.2004;40:314)I儿】LiiMQ,ChenSH.DongJS,"fangK.ChinJMaterRes,
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含铜抗菌不锈钢的抗菌特性研究
作者:
作者单位:南黎, 刘永前, 杨伟超, 徐慧, 李瑛, 吕曼祺, 杨柯, NAN Li, LIU Yongqian,YANG Weichao, XU Hui, LI Ying, L(U) Manqi, YANG Ke南黎,刘永前,NAN Li,LIU Yongqian(中国科学院金属研究所,沈阳,110016;中国科学院研究
生院,北京,100049), 杨伟超,YANG Weichao(中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳
,110016;中国科学院研究生院,北京,100049), 徐慧,XU Hui(中国科学院沈阳应用生态研究
所,沈阳,110016), 李瑛,吕曼祺,杨柯,LI Ying,L(U) Manqi,YANG Ke(中国科学院金属研究
所,沈阳,110016)
金属学报
ACTA METALLURGICA SINICA
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