鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立_姬希文

第33卷第8期2011年8月

中国预防兽医学报

Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine

Vol. 33，No.8Aug. 2011

doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2011.08.12

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立

姬希文1,2，闫丽萍1，颜丕熙1，李国新1，张七斤2，李泽君1*

(1.中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫重点开放实验室，上海200241；

2. 内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018)

摘要：为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法，本研究利用纯化的DTV 奉贤株(FX2010)作为包

被抗原，建立了检测DTV 血清抗体的间接ELISA 方法，并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔，抗原最佳包被条件为37℃放置2h 后，4℃下过夜，血清的最佳稀释度为1∶200，酶标抗体最适稀释度为1∶2000。在优化条件下，阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA 方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I 型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测，均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%，显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA 方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测，有108份样品呈现阳性，而琼扩试验只有32份呈阳性结果，而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品，证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV 抗体间接ELISA 的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。

关键词：鸭坦布苏病毒；间接ELISA ；抗体中图分类号：S852.65

文献标识码：A

文章编号：1008-0589(2011)08-0630-05

Establishment of an indirect ELISA for detection of

antibody against duck Tembusu virus

JI Xi-wen 1,2, YAN Li-ping 1, YAN Pi-xi 1, LI Guo-xin 1, ZHANG Qi-jin 3, LI Ze-jun 1*

(1.Animal Parasitology Laboratory of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China; 2. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Abstract :An indirect ELISA was established for rapid detection of antibodies against duck Tembusu virus (DTV)using purified DTV (FX2010isolate) as coating antigen. The reaction conditions were optimized, including 1.675μg/wellcoating antigen of purified the virus, 1∶200dilution of testing serum and 1∶2000dilution of HRP conjugated anti-duck IgG with cut off-value of 0.432(OD450nm ). The specific tests showed that there were no cross-reaction to the anti-sera against avian influenza virus, Newcastle disease virus, reticuloendotheliosis virus, duck hepatitis virus-I, reovirus and avian leukemia virus, which indicated that the ELISA was specific to anti-sera against DTV. The intra-and inter-assay demonstrated that the coefficient of maximum variation was 2.9%and 3.9%respectively. A total of 140serum samples from affected ducks were tested and 108samples were positive detected by the indirect ELISA, while only 32samples showed positive by agar immunodiffusion test. The results revealed the indirect ELISA could be used for laboratory diagnosis and sero-survey for duck tembus virus infection.

Key words :duck tembus virus; indirect ELISA; antibody *Corresponding author

收稿日期：2011-06-10

基金项目：农业部动物转基因专项(2009ZX08010-022B)；公益性行业(农业) 专项经费资助(201003012)作者简介：姬希文(1984-)，女，河南新乡人，硕士研究生，主要从事禽传染病研究. *通信作者：E-mail ：[email protected]

第8期姬希文，等. 鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立631

鸭坦布苏病毒(DuckTembusu virus ，DTV) 属于黄病毒科、黄病毒属的坦布苏病毒[1]，该病毒引起的鸭传染病被称为DTV 病。2010年在华东地区首次发生该病的流行，并迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏等省份的主要水禽养殖场，之后继续传播到广东、山东、河南、河北等省市，到目前为止全国大部分主要水禽养殖地区均已受到该病的威胁。鸭子感染该病毒后，主要的临床症状表现为：病鸭出现高热、沉郁、厌食等；蛋鸭出现产蛋量急剧下降甚至停止；肉鸭出现生长迟缓。该病的发病率高达100%，死亡率在5%～10%之间[2-3]。

面对目前这种严峻局势，为了制定合理的防制措施，必需详细了解鸭群感染情况，因此急需一种快速检测DTV 抗体的方法。本研究中我们以纯化的DTV 做抗原，建立了检测抗DTV 抗体的快速、特异性间接ELISA 方法。

pH 9.6碳酸盐缓冲液从1∶10开始进行倍比稀释，每孔100μL 横向包被酶标板，4℃过夜。阳性血清和阴性血清分别从1∶100开始纵向倍比稀释，酶标二抗羊抗鸭IgG-HRP 作1∶2000稀释，其它步骤按ELISA 程序进行[4-6]。最后加入100μL/孔TMB 底物，作用5min ～10min ，再加入2M 浓硫酸100μL/孔终止反应，用酶标仪测OD 450nm 值。1.5

抗原最佳包被条件的确定

采用最佳抗原包被

浓度和最佳血清稀释度，分别以37℃1h 、37℃2h 、37℃3h 后4℃过夜3种不同的条件包被提纯的全病毒蛋白，其他条件不变，用DTV 阳性血清和阴性血清进行间接ELISA 测定，确定抗原的最佳包被条件。1.6

酶标二抗最佳工作浓度的确定

采用上述中的

最佳抗原包被浓度、最佳包被条件以及最佳血清稀释度，将羊抗鸭IgG-HRP 二抗做1∶1000～1∶8000稀释进行间接ELISA 测定，以确定酶标二抗的最佳工作浓度。1.7

酶标二抗最佳工作时间

采用最佳抗原包被浓

1

1.1

材料和方法

病毒株及血清

DTV FX2010分离株为本实验

度、最佳包被条件以及最佳血清稀释度以及最佳二抗稀释浓度，将酶标二抗分别作用30min 、45min 、90min ，测OD 450nm 值确定酶标二抗的最佳工作时间。1.8

间接ELISA 阴性和阳性临界值的确定

按上

述建立的间接ELISA 方法，对实验室保存的40份鸭血清(已知DTV 阴性抗体) 进行检测。每份样品重复3孔，结果取其平均值，计算样本OD 450nm 值的平均值() 和标准方差(SD)，根据统计学原则，样本的OD 450nm 值>阴性样本OD 450nm 值的+2SD时，可以在99.9%的水平上判为阳性[7-8]。1.9

特异性试验

用建立的间接ELISA 方法分别

检测AIV 、NDV 、REV 、DHV-I 、RV 和ALV 等的阳性血清，以验证本实验建立的间接ELISA 方法是否对其它病毒的阳性血清有交叉反应性。1.10

敏感性试验

将DTV 标准阳性血清做1∶100

～1∶12800倍比稀释，其余条件按最佳反应条件进行试验。1.11

重复性试验

批内重复性实验：用建立的间

接ELISA 方法测定不同抗体滴度的6份DTV 阳性血清。血清按1∶200稀释，加到同一批制备的全病毒抗原包被不同的ELISA 板，每份血清做4孔平行，根据每份血清的OD 450nm 值计算出标准差，进而

室分离保存；标准阳性血清由本实验室通过FX2010株制备的灭活苗免疫DTV 病阴性鸭制备；标准阴性血清为采集未免疫DTV 疫苗、临床症状健康、经病毒分离琼脂扩散试验检测为DTV 阴性的鸭的血清；禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、网状内皮增生病病毒(REV)、I 型鸭肝炎病毒(DHV-1)、呼肠孤病毒(RV)和禽白血病病毒(ALV)阳性血清均由本所禽病实验室提供；现地血清样品采集自浙江和上海等地区。1.2

主要试剂

羊抗鸭IgG-HRP 购自KPL 公司，

TMB 显色液购自武汉博士德公司；蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。1.3

抗原的制备

将DTV FX2010株(病毒含量为

105.25ELD 50/100μL) 稀释10倍，取1mL 于鸭成纤维细胞(DEF)上，吸附2h ，用PBS 洗一次，加入含2%FBS 的DMEM 细胞培养液，于37℃，5%CO 2条件下培养72h 后收获细胞上清，将其7000r/min离心40min ，取上清经30000r/min超速离心3h ，病毒沉淀用0.01M 的PBS (pH7.4)悬浮，测定病毒蛋白含量。1.4

抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定用方阵滴定法[4]，将纯化后的全病毒溶液用0.05M

632中国预防兽医学报2011年

计算出每份血清OD 450nm 值的板内变异系数。在3块板上重复该试验，根据测得的OD 450nm 值计算出板间每份血清OD 450nm 值的变异系数(CV)。

批间重复性试验：将3个不同批次纯化的全病毒蛋白按最佳包被量包被同一ELISA 检测板，对6份鸭抗DTV 阳性血清进行间接ELISA 检测，对结果进行统计学分析。1.12

符合率试验

以确定的各种最佳条件进行间

接ELISA 试验与琼扩试验(AGP)进行比较，对浙江、上海等地区共140份样品进行检测，将用间接ELISA 方法检测相同血清所得的阴阳性判定结果与传统的琼扩试验进行比较，得出两者的阳性检出率和符合率[9]。

OD 450nm values

Table 2

表2抗原最佳包被条件的确定

The optimization of coating condition of antigen

Coating condition of antigen

1h at 37℃1.2370.3243.817

3h at 37℃1.1860.2375.004

2h at 37℃and 4℃16h

1.0840.1835.923

Positive value Negative value P/Nratio

2.4酶标二抗最佳工作浓度的确定当酶标二抗羊

抗鸭IgG-HRP 以1∶2000稀释时，阳性血清与阴性血清的OD 450nm 值相差最大。因此，将1∶2000确定为酶标二抗的最佳工作浓度(表3) 。

表3酶结合物最佳作用浓度的确定Table 3Determination for optimal dilution of

secondary antibody

Dilution of IgG-HRP 1∶1,0001∶2,0001∶4,0001∶8,0001∶16,000

OD 450nm value

Positive serum Negative serum 1.3240.3341.1670.1831.0840.1760.9960.1580.7650.134

2

2.1

结果

将纯化的全病毒用蛋

纯化的DTV 蛋白定量

白定量试剂盒来进行定量，检测结果病毒蛋白浓度为0.6702mg/mL。2.2

抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

2.5

方阵滴定显示，当血清的稀释度为1∶200，抗原的稀释浓度为1∶400，即每孔包被量为1.675μg 时(表1) ，阳性血清的OD 450nm 值可达1.038，而阴性血清的OD 450nm 值为0.227，阴性与阳性血清的OD 450nm 值相差最大(P/N=4.559)。因此，选择1∶200为最佳血清稀释度，1.675μg/孔为抗原的最佳包被量。

Table 1

表1方阵滴定的OD 450nm 值

The optimization of coating concentration with virus

by checkerboard titration

Serum dilution 1:1001:2001:4001:800

Different dilutions of coating antigen

(OD450nm values) 1:101.3681.3281.3111.3080.4850.3790.2770.262

1:201.3511.3481.3381.3250.3820.3770.3010.256

1:401.3651.3781.3451.3180.2740.2380.2690.253

1:801.3411.3471.3421.3320.2670.2490.2370.229

1:1601.2421.2211.1951.1840.2480.2390.2280.218

1:3201.1881.1211.0871.0470.2350.2160.2090.198

酶标二抗最佳作用时间羊抗鸭IgG-HRP 以

1∶2000稀释时，作用45min 时阳性血清与阴性血清的OD 450nm 值比值最大。因此，将该浓度确定为酶标二抗的最佳工作时间(表4) 。

表4酶标抗体最佳作用时间的确定

Table 4Determination for optimal reaction time of

secondary antibody

Serum Positive Negative P/N

45min 1.6170.2835.714

Incubating time

90min 1.860.3804.89

120min 2.050.4874.21

Serum 阳性血清Positive serum

2.6间接ELISA 阴阳性临界值的确定对40份

DTV 阴性血清进行间接ELISA 检测。求平均值为0.317，标准差SD 为0.057，根据公式：阴阳性临界值=+2SD，实验临界值为0.432。即待测样品的OD 450nm 值≥0.432时为阳性，OD 450nm 值

0.6

O D 450n m v a l u e

1:100阴性血清

Negative serum 1:200

1:4001:800

0.50.40.30.20.10

[***********][**************]39

2.3抗原最佳包被条件的确定用检测的抗原

1.675μg/孔包被酶标板，结果表明，在37℃2h 后4℃16h 包被，P/N值最高，证明包被效果较好。因此，将该条件确定为全病毒的最佳包被条件(表2) 。

Negative serum samples

图140份鸭阴性血清间接ELISA 检测结果

Fig.1The detection of 40negative serum samples by indirect ELISA

第8期姬希文，等. 鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立633

2.7特异性试验用建立的间接ELISA 方法对2.10对比试验应用建立的间接ELISA 方法与琼

AIV 、NDV 、REV 、DHV-I 、RV 、ALV 和DTV 的阳性血清进行测定，其OD 450nm 值分别是0.217、0.328、0.138、0.337、0.225、0.256、1.167，其他病毒的阳性血清OD 450nm 值均小于阴阳性临界值0.432，表明建立的间接ELISA 方法具有较好的特异性[6]。2.8

敏感性试验

抗原按最佳包被浓度和条件进行

包被，将DTV 阳性血清分别做1∶100～1∶12800倍比稀释，其余条件按最适反应条件进行间接ELISA 。结果显示，1∶6400稀释后仍可检测为阳性，而1∶12800稀释的阳性血清检测结果低于0.432(表5) 。

表5间接ELISA 敏感性试验结果

Table 5The sensitivity test of the indirect ELISA

Serum dilution 1:1001:2001:4001:8001:1,6001:3,2001:6,4001:12,800

OD 450nm Value

Negative serum Positive serum

0.2871.285

0.2271.035

0.1810.935

0.1670.683

0.1630.564

0.4600.099

0.0760.441

0.0690.385

脂扩散试验(AGP)比较，对140份来自浙江、上海等地的鸭血清样品进行检测，检测结果见表7，两者的阳性符合率为100%，阴性符合率为87.5%，总符合率达到42.85%[10]。

表7

血清样品的AGP 与间接ELISA 检测结果比较

Table 7The comparision of serum detection

by AGP and indirect ELISA

Total Positive Negative Negative Detection Positive

Method samples Coincidence samples Coincidence Coincidence

100%32ELISA 108(32*)42.85%87.5%

108(28*)AGP 32*指在间接ELISA 实验与琼脂扩散实验(AGP)平行检测结果相同

的数值

*The identical number of the detection results between indirect ELISA and AGP

3讨论

自2010年以来，DTV 造成的经济损失越来越严重[10]，到目前为止，国际上通用的黄病毒属血清学检测方法有ELISA 、AGP 、血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CF)和中和实验(NT)等[11]，虽然AGP 操作比较简单，但耗时长，而且敏感性较低。而本研究建立的方法以纯化的DTV 作为间接ELISA 的包被抗原，即含有DTV 各亚型保守的E 蛋白和基质蛋白抗原，也包含其他抗原组分，其抗原性和免疫原性高，与AGP 试验结果相比较，其检出DTV 为阳性率高，证明该间接ELISA 方法敏感性更强，更适宜于现地及实验室DTV 抗体的检测。本实验室为鸭坦布苏病流行病学调查、生物安全预警和有效防制提供了一种快速有效的检测方法。

间接ELISA 是血清学诊断的常用方法，其优点是特异性强，灵敏度高及检测速度快。其中抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定关键；间接ELISA 结果的判定方法有多种，如P/N法，终点法和单稀释法等。本实验采用P/N法，如果被检血清的值在0.432以上为阳性，在其以下为阴性，在检测临床样品时发现阴性背景值很高，我们将二抗的作用时间进行不同的时间缩短，发现二抗的作用时间缩短到45min ，这时背景值明显降低，表明在检测血清时，应尽量减少二抗的作用时间，以免引起过多的非特异性反应。

用该间接ELISA 方法检测140份临床鸭血清样

2.9重复性试验批内重复性试验是将6份本实验

室保存的不同抗体滴度的DTV 血清，用同一批包被的酶标板各重复检测4次，计算标准偏差。结果，重复试验中变异系数最大为2.9%，最小为1.4%，表明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性(表6) 。

批间重复性试验是将不同批次抗原按相同浓度包被酶标板，每份血清用同批抗原包被的3块ELISA 板检测，共检测6份血清，表6结果显示，每份血清在不同板间的OD 450nm 读数相差甚微，其变异系数控制在4%以下，表明同一样品在不同批次抗原试验中变异程度很小，具有良好的重复性。

表6批内和批间重复性实验结果

Table 6Intro-batchand inter-batch duplicability test

Serum dilution

组内变异试验组内变异试验

Intra-assay variability (CV)Intra-assay variability (CV)平均数变异系数±SD CV (%)

2.40.162±0.004

2.90.184±0.005

2.00.193±0.004

1.40.362±0.005

1.40.568±0.008

平均数变异系数

±SD CV (%)

1.170.473±0.006

1.210.588±0.007

3.200.351±0.011

1.100.327±0.004

1.960.202±0.004

1:400

1:8001:1,6001:3,2001:6,400

634中国预防兽医学报2011年

品的DTV 总阳性率为21%。目前为止，该病已经遍布全国大部分地区，应引起足够的重视[12]。

本研究建立的间接ELISA 方法虽然灵敏性较好，但还有些不足之处：该方法中所用的检测试剂(包被液、封闭液、酶标抗体等) 尚未标准化；抗原制备比较复杂，今后将更进一步优化实验条件，以找到易于纯化和大量制备抗原的方法，以便能够更快的检测该病毒的血清抗体。

[8][7][6]

方法的建立与应用[J].畜牧与兽医，2010，42(4)：17. 宫晓炜，邱昌庆，蔺国珍，等. 牛布氏杆菌间接ELISA 检测方法的建立[J].中国兽医科学2010，40(6)：598-602. 吴鹏，曹瑞兵，周斌，等. 乙脑病毒非结构蛋NS1的原核表达及重组蛋白间接ELISA 方法的初步建立[J].畜牧与兽医，2010，42(3)：5-8.

Alcon S, Talarmin A, Debruyne M, et al. Enzyme linked im-munosorbent assay specific to dengue virus type I nonstructural protein NS1reveals circulation of the antigen in the blood during the acute phase of disease in patients experiencing primary or

参考文献：

[1]

Monath T P. The Togaviridae and the Flaviviridoe [M].New York:Plenum Press, 1996, 375-440. [2]

滕巧泱，颜丕熙，张旭，等. 一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J].中国动物传染病学报，2010，18(6)：1-4. [3]

万春和，施少华，程龙飞，等. 一种引起种(蛋) 鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报，2010，25(6)：663-666. [4]

巴德山. 现代免疫学实验技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998，158-162. [5]

沈婷，周斌，陈溥言. 检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA

secondary infections [J].Clin Microbiol, 2002, (40):376-381. [9]

靳岷，邵国青. 检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA 方法与单抗阻断ELISA 方法的对比试验[J].兽医研究，2009，(237)：17-19.

[10]Chambers T J , Hahn C S, Galler R, et al. Flavivirus genome

organization, expression, and replication [J].Annu Rev Microbiol, 1990, 44:649-688.

[11]朱立平，陈学清. 免疫学常用实验方法[M].北京：人民军

医出版社，2000，56.

[12]Gould E A, Moss S R, Turner S L. Evolution and dispersal of

encephalitic flaviviruses [J].Arch Virol, 2004, (Suppl.18):65-84.

(本文编辑：赵晓岩)

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Intervirology, 1982, 17:42-46. [4]

Mackett M, Smith G L, Moss B.Vaccinia virus:A selectable eukaryotic cloning and expression vector [J].Proc Nat Acad Sci USA, 1982, 79:7415-7419. [5]

Baldick C J , Jr Keck J G, Moss B. Mutational analysis of the core, spacer, and initiation regions of vaccinia virus intermedi-ate-class promoters [J].J Virol, 1992, 67:3515-3527. [6]

Cochran M A, Puckett C, Moss B. In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene:evidence for tandem early and late regulatory signals [J].J Virol, 1985, 54:30-37. [7]

Davison A J, Moss B. Structure of vaccinia virus early promot-ers [J].J Mol Biol, 1989, 210:749-769. [8]

Davison A J, Moss B. Structure of vaccinia virus late promoters [J].J Mol Biol, 1989, 210:771-784. [9]

Weir J P, Moss B. Determination of the transcriptional regulato-ry region of a vaccinia virus late gene [J].J Virol, 1987, 61:75-80.

[10]Kumar S, Boyle D B. A poxvirus bidirectional promoter ele-ment with early/lateand late functions [J].Virology, 1990, 179:151-158.

[11]Kumar S, Boyle D B. Activity of a fowlpox virus late gene pro-moter in vaccinia and fowlpox virus recombinants [J].Arch Virol, 1990, 112:139-148.

[12]Zantinge J L, Krell P J, Derbyshire B J, et al. Partial transcrip-tional mapping of the fowlpox virus genome and analysis of the EcoRI L fragment [J].J Gen Virol, 1996, 77:603-614. [13]Romero C H, Barrett T, Evans S A, et al. Single capripoxvirus

recombinant vaccine for the protection of cattle against rinder-pest and lumpy skin disease [J].Vaccine, 1993, 11:737-742. [14]Romero C H, Barrett T, Chamberlain R W, et al. Recombinant

capripoxvirus expressing the hemagglutinin protein gene of rinderpest virus:protection of cattle against rinderpest and lumpy skin disease viruses [J].Virology, 1994, 204:425-429.

[15]Romero C H, Barrett T, Kitching R P, et al. Protection of goats

against peste des petits ruminants with recombinant capripox-virus expressing the fusion and hemagglutinin protein genes of rinderpest virus [J].Vaccine, 1995, 13:36-40.

[16]Wade-Evans A M, Romero C H, Mellor P, et al. Expression of

the major core structural protein (VP7)of bluetongue virus by a recombinant capripox virus, provides partial protection of sheep against a virulent heterotypic bluetongue virus challenge [J].Virology, 1996, 220:227-231.

[17]Boyle D B. Quantitative assessment of poxvirus promoters in

fowlpox and vaccinia virus recombinants [J].Virus Genes, 1992, 6:281-290.

(本文编辑：赵晓岩)