实用双向电泳教程

双向电泳实验教程

一、实验过程

1、蛋白质干粉的制备

可溶性蛋白提取法

1．于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g

2．放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml 离心管中

3．加入15ml 提取缓冲液，震荡摇匀15-30 min，于冰山超声1h 4．11000rpm ，4℃，15min ，取上清

5．再加入15ml 提取缓冲液，震荡摇匀15-30 min，11000rpm ，4℃，15min ，取上清 6．合并上清，加入4倍体积TCA/丙酮溶液，11000rpm ，4℃，20min ，弃上清 7．丙酮清洗3次然后真空抽干

8．按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解1~2h 9. 11000rpm，15min ，取上清即为蛋白样品 10．样品放置于-20℃冰箱

TCA 丙酮法

1．于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g

2．放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml 离心管中 3．加入TCA 抽取液20ml, 震荡，-20℃沉淀过夜 4．11000rpm ，4℃，15min ，去上清

5．加入20ml-20℃预冷的冷丙酮（内含0.07%β-巯基乙醇）震荡，静置2h ，然后11000rpm ， 15min ，去上清（一般重复3次，洗至沉淀白色或者不能变色为止） 6．沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干 7．按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解1~2h

8. 11000rpm，15min ，取上清即为蛋白样品（此步剩下的残渣可以先留着） 9．样品放置于-20℃冰箱 药品配方：

TCA/丙酮抽取液：25gTCA （10%），0.07%β-巯基乙醇定容于250ml 丙酮中

苯酚提取法

1．于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g

2．放到研钵中，液氮研磨充分，移入50ml 离心管中

3．加入蛋白提取液15ml, 震荡使其混合均匀即可，于冰上放置30min 4．加入等体积的Tris 平衡酚，震荡使其混合均匀，于冰上放置30min 5．11000rpm ，4℃，,20min ，收集上层酚层。 6. 用抽提液洗酚层2次

7. 加入5倍体积的甲醇醋酸铵，沉淀静止过夜 8．11000rpm ，4℃，,30min ，去上清

9. 用洗液1洗涤沉淀，11000rpm ，4℃，,30min ，去上清 10．用洗液2洗涤沉淀，11000rpm ，4℃，,30min ，去上清 11．沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干

12．按适当比例加入裂解缓冲液，室温超声溶解1~2h，溶解的样品即为蛋白样品 13, 。将样品放置于-20℃冰箱中保存。

药品配方： 蛋白提取液

1%PVP，0.7M 蔗糖，0.1M Kcl，0.5M Tris-Hcl，500Mm EDTA.2Na，1mM PMSF,2%β-Me 洗液1

80%丙酮（0.07%β-Me ） 3．洗液2

100%丙酮（0.07%β-Me ）

2、样品的溶解

取蛋白干粉10mg 于1.5ml 的离心管中，加入200－250ul 裂解液（先加100-200ul 左右，用小棒研磨后，再逐次加入余量裂解液，冲洗小棒），振荡1min 左右，于35℃水浴2.5小时，15000rpm 离心15min ，取上清液作为实验备用。 3、Bradford 法测蛋白含量

1)、将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4℃冰箱

2)、设7个浓度梯度制作标准曲线，每个梯度设3个重复，依下表加入1mg/ml BSA 、0.1M Hcl 、ddH 2O 。(均使用10ml 离心管) 管号 ddH 2O(ul) 1mg/ml BSA(ul) 0.1M Hcl

0 90 0 10

1 80 10 10

2 70 20 10

3 60 30 10

4 50 40 10

5 40 50 10

6 30 60 10

7 20 70 10

8 10 80 10

9 0 90 10

3)、每管加入5ml Bradford工作液，摇匀，5min 后测波长595nm 下的吸光值。测定过程中，每测完1管，比色皿用95%乙醇冲洗后再用蒸馏水冲洗3次，然后取少量下1管的溶液润洗比色皿2次。

4)、制作BSA 含量与OD 595关系的标准曲线方程式：

Y= aX+b.其中Y 为 OD值，X 为蛋白含量。 a、b 及相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得。其中R 最好大于0.95。

5)、样品液蛋白质的定量

取10ul 样品液, 加入10ul 0.1M Hcl,80ul ddH 2O, 加入5ml Bradford工作液，操作方法与制作标准曲线相同。根据定量结果计算样品液的取量及加入水化液的量。

2

4、第一向电泳IEF

1) 、依据定量结果取适量上清液，加泡胀液至终体积为0.45ml ，振荡片刻,15000r 离心5min 除杂质，取上清用于上样。

2) 、选用24cm 长IPG 胶条，将IPG 胶条从-20℃取出后置室温下放置5min 。向IPG 胶条槽(strip holder) 中加入0.45ml 溶有样品的泡胀液后，再将IPG 胶条去掉保护膜，胶面向下放入胶条槽中，酸性端对应正极，碱性端对应负极；慢慢的抬高或放低胶条，除去胶面与泡胀液间的气泡，然后滴加0.7-0.8ml 覆盖油，盖上胶条槽的盖子，放于Ettan-IPG 等电聚焦仪(IPGphor)上，泡胀和等电聚焦的参数见表1。再水化及等电聚焦条件均设置为20℃，

50uA/strip。 IEF 参数设置 steps Voltage(v) Time(h)

1 500 1

2 1000 6

3

8000(gradient)

3

4 8000 4

5 1000 30

S1、S2用于去小离子，并有利于高分子量蛋白进入胶条，S3和S4用于聚焦，为防聚焦完毕后无人值守或其它操作尚未完成而设置了S5。(进行等电聚焦之前，先让泡胀液与胶条充分接触，一般过夜或者12h)

*在进行IEF 时，室温易保持在20-23℃之间为宜，以免IPGphor 的电板出现冷凝水而可能导致的仪器短路事故。

5、胶条平衡

等电聚焦后，用镊子迅速取出IPG 胶条(夹住负极端) ，用滤纸上放置片刻(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸) ，以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上放入平衡管中，平衡Ⅰ(15ml)和平衡Ⅱ(15ml)分别平衡15min 。取出胶条后用滤纸小心吸去残余平衡液，用电极缓冲液润洗1秒钟，准备转移至第二向SDS-PAGE 胶上。 * 平衡时要注意保持胶面始终向上, 不能接触平衡管壁。

6、第二向电泳SDS-PAGE

将平衡好的IPG 胶条贴于凝胶玻璃板上，移至分离胶上端，避免IPG 胶条与SDS-PAGE 胶上沿间产生气泡。将10ul 低分子量标准蛋白于沸水中煮5min ，剪一张0.3cm ×0.5cm 的滤纸片，置于胶条的酸性端，吸取标准蛋白液至滤纸片上，用封胶液(不能太热，50℃左右为宜) 封住胶条及滤纸片，待封胶液凝固后，在电泳槽中放上上槽，将凝胶板插入Ettan DALTII 的缓冲液柜中，用代用板插满空位置。在18℃水循环条件下进行电泳，起初恒流10mA/胶 30min后，换用50mA/胶，待示踪溴酚蓝至凝胶底部边缘时停止电泳。

TM

7、蛋白质检测

电泳结束后，剥下胶板，放入染色液中于室温摇床摇动染色8h, 随后经脱色液脱色处理至背景变浅、蛋白点清晰可见，其间更换脱色液数次。脱色后的凝胶用蒸馏水冲洗3次，用Image Scanner电泳扫描仪进行扫描，分辩率设置为300dpi(或600 dpi)、24位全彩。

二、相关溶液配置

1、提取液：

mM PMSF，10 mM DTT）

100mmol/LTris 、50mmol/L抗坏血酸、100mmol/L氯化钾、50mmol/L硼砂、1％Triton X －100、2%β－巯基乙醇。

1.5mmol/LTris－Hcl 13.3ml 抗坏血酸 1.76g Kcl 1.49g 硼砂 3.81g PMSF 0.035g

可溶性提取缓冲液（20 mM Tris-Hcl ，pH8.0，20 mM Nacl ，20

β－巯基乙醇 4ml dd H2O to 200ml

TCA/丙酮抽取液：25gTCA （10%），0.07%β-巯基乙醇定容于250ml 丙酮中

可溶性蛋白提取液：

1%PVP，0.7M 蔗糖，0.1M Kcl，0.5M Tris-Hcl，500Mm EDTA.2Na，1mM PMSF,2%β-Me 洗液1

80%丙酮（0.07%β-Me ） 3．洗液2

100%丙酮（0.07%β-Me ）

2、裂解液：

7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(W/V) CHAPS 、2%(V/V) 两性电解质载体，–20℃保存。 Urea 4.2 g Thiourea 1.5224 g CHAPS 0.4 g Pharmelyte 3~10 50 ul dd H2O to 10 ml

注：1) 使用前加入20mMDTT(根据不同样品，加入DTT 的量可作适当调整，如20、30、

40、50mMDTT 等) 。

2) Pharmelyte 的PH 值最好与胶条的范围一致。

3、 水化液：

7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%(W/V)CHAPS 、0.5%(V/V) IPG buffer，–20℃保存。 Urea 2.1 g Thiourea 0.75 g CHAPS 0.1 g Bromophenol blue(1%) 10 ul dd H2O to 5 ml

注：使用前每1 mL 水化液加5ul IPG IPG buffe，加入的DTT 量与裂解液中的用量相同，然后加入痕量溴酚蓝，用前加入少量DTT 和10ulPH3-10的电解质。

4、1%溴酚蓝贮液

Bromophenol blue 100 mg dd H2O to 10 ml

5、 平衡液：

50 mmol/L Tris-HCl pH8.8、尿素6 mol/L、30%(V/V) 甘油、2%(W/V) SDS 、少量溴酚蓝，–20℃保存。

Tris-HCl, pH 8.8 10 ml

Glycero(87%) 69 ml SDS 4 g dd H2O to 200 ml 使用前，2次平衡分别加入：

平衡液Ⅰ：每10ml 平衡液加DTT100mg ； 平衡液Ⅱ：每10ml 平衡液加碘乙酰胺250mg 。

6、 SDS-PAGE 凝胶储液：

30%(W/V) 丙烯酰胺，0.8%(W/V) 甲叉双丙烯酰胺，保存于棕色瓶，4℃ Acrylamide (FW 71.08): 60.0 g N,N’-Methylene bisacrylamide (FW 154.17) 1.6 g ddH 2O To 200 ml

7、 SDS-PAGE 凝胶缓冲液：

1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，4 ℃保存。 Tris base (FW 121.1) 36.34 g ddH 2O about 100~150 ml 浓HCl adjust to pH 8.8 ddH 2O to 200 ml 8、 SDS-PAGE 电极缓冲液：

Tris 0.025 mol/L，甘氨酸0.192 mol/L，0.1%(W/V) SDS，pH 8.3。 可先配成10X SDS electrophoresis buffer，使用前再稀释。 10倍电极缓冲液： Tris base 12.1 g； glycine 57.6 g； SDS 4.0 g ddH 2O to 400 ml

9、封胶液：

SDS elctrophoresis buffer 100 ml

Agarose 0.5 g

10、染色液(200ml)：

磷酸 100ml 硫酸铵 100g G250 1.2g 甲醇 200ml

11、脱色液：

甲醇 50ml 乙酸 70ml + 蒸馏水 to 1 L

12、Bradford 贮存液（350ml 的量）

95%乙醇 100ml 88%磷酸 200ml G-250 350mg

保存于棕色瓶中，室温下长期保持稳定。

13、Bradford 工作液(500ml配方)

双蒸水 425ml

95%乙醇 15ml 88%磷酸 30ml Bradford 贮存液 30ml

保存于室温棕色瓶中，一般使用期不超过5-6个星期为宜。使用前需过滤。 14、10%SDS（十二烷基硫酸钠）：1gSDS 定容到10ml 15、10%AP（过硫酸铵）:1gAP定容至10ml