色谱质谱联用技术1
色谱质谱联用技术
摘要:色谱质谱联用是分析化学发展最快,应用最广的分析方法之一,本文综合介绍了GC-MS和LC-MS的联用技术及其应用。
关键词:GC-MS;LC-MS
Chromatography - mass spectrometry
Abstract: Chromatography - mass spectrometry is one of the fastest growing, most widely used methods in analytical chemistry, this article presented GC-MS and LC-MS technology and their applications.
Key words:GC-MS;LC-MS
色谱是一种快速、高效的分离技术,但不能对分离出的每个组分进行鉴定;质谱是一种重要的定性鉴定和结构分析的方法,一种高灵敏度、高效的定性分析工具,但没有分离能力,不能直接分析混合物。二者结合起来,把质谱仪作为色谱仪的检测器将能发挥二者的优点,具有色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度,是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。本文分别从GC-MS和LC-MS两方面介绍一下关于色谱-质谱联用的应用技术。
色谱联用中的接口:接口是色质联用的关键技术。
常用色谱联用技术:GC-MS使用EI源,所获得的质谱碎片信息量大,重复性好,有几十万张质谱数据库,是最成熟的色质联用装置,但由于受样品的挥发性限制,适用范围不及LC-MS。
LC-MS是最重要的分离分析方法,广泛应用于药物分析生物样品、药物代谢、临床诊断、食品环保分析,目前尚无谱库检索,但质谱给出大量碎片离子的信息及准分子离子的质荷比,鉴定能力极高。
二、 质谱仪器简介
真空系统:质谱仪必须在良好的真空条件下才能正常。真空系统为离子源和质量分析器提供真空条件。机械油泵抽低真空,涡轮分子泵抽至高真空。
原因:1、离子的平均自由程必须大于离子源到收集器的飞行距离。防止粒子与残留气体的分子碰撞,保证待测离子到达检测器。
2、高真空可延长灯丝寿命。氧分分压过高会影响电子轰击离子源中灯丝的寿命。
3、减少本底干扰。电离盒气压高时,发生离子-分子反应并改变碎片质谱,这些碎片质谱会影响质谱图及分析结果。
离子源
离子源:接受样品产生离子,常见的离子化方式有:
l、电子轰击离子化(electron impact ionization,EI)
EI是最常用的一种离子源,有机分子被一束电子流(能量一般为70eV)轰击,失去一个外层电子,形成带正电荷的分子离子(M+),M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基,在电场作用下,正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。
1电离效率高,能量分散小,结构简单,操作方便。 EI特点:○
2图谱具有特征性,化合物分子碎裂大,能提供较多信息,对化合物的鉴别和结○
构解析十分有利。
3所得分子离子峰不强,有时不能识别。 ○
4本法不适合于高分子量和热不稳定的化合物。 ○
2化学离子化(chemical ionization,CI)
将反应气(甲烷、异丁烷、氨气等)与样品按一定比例混合,然后进行电子轰击,甲烷分子先被电离,形成一次、二次离子,这些离子再与样品分子发生反应,形成比样品分子大一个质量数的(M+1) 离子,或称为准分子离子。准分子离子也可能失去一个H2 ,形成(M-1)离子。
1不会发生象EI中那么强的能量交换,较少发生化学键断裂,谱形简CI特点:○
2分子离子峰弱,但(M+1) 峰强,这提供了分子量信息。 单。○
3场致离子化(field ionization,FI)
适用于易变分子的离子化,如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素、苯丙胺类等。能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。
4场解吸离子化( field desorption ionization, FD)
用于极性大、难气化、对热不稳定的化合物。
5负离子化学离子化(negative ion chemical ionization,NICI)
是在正离子MS的基础上发展起来的一种离子化方法,其给出特征的负离子峰,具有很高的灵敏度(10-15 g)。
质量分析器:将电离室中生成的离子按质荷比(m/z)大小分开,进行质谱检测。常见质量分析器有
l四极质量分析器(quadrupole analyzer)
原理:由四根平行圆柱形电极组成,电极分为两组,分别加上直流电压和一定频率的交流电压。样品离子沿电极间轴向进入电场后,在极性相反的电极间振荡,只有质荷比在某个范围的离子才能通过四极杆,到达检测器,其余离子因振幅过大与电极碰撞,放电中和后被抽走。因此,改变电压或频率,可使不同质荷比的离子依次到达检测器,被分离检测。
2扇形质量分析器
磁式扇形质量分析器(magnetic-sector mass analyzer)
被电场加速的离子进入磁场后,运动轨道弯曲了,离子轨道偏转可用公式表示:
当H,V一定时,只有某一质荷比的离子能通过狭缝到达检测器。
特点:分辨率低,对质量同、能量不同的离子分辨较困难。
3双聚焦质量分析器(double-focusing mass assay)
由一个静电分析器和一个磁分析器组成,静电分析器允许有某个能量的离子通过,并按不同能量聚焦,先后进入磁分析器,经过两次聚焦,大大提高了分辨率。
4离子阱检测器(ion trap detector)
原理类似于四极分析器,但让离子贮存于井中,改变电极电压,使离子向上、下两端运动,通过底端小孔进入检测器。
检测器: 将离子束转变成电信号,并将信号放大,常用是电子倍增管。当离子撞击到检测器时引起倍增器电极表面喷射出一些电子,被喷射出的电子由于电位差被加速射向第二个倍增器电极,喷射出更多的电子,由此连续作用,每个电子碰撞下一个电极时能喷射出2-3个电子,通常电子倍增器有14级倍增器电极,
可大大提高检测灵敏度。
色质联用常用测定方法总离子流色谱法(total ionization chromatography,TIC)—— 类似于GC 图谱,用于定量。l反复扫描法(repetitive scanning method,RSM)——按一定间隔时间反复扫描,自动测量、运算,制得各个组分的质谱图,可进行定性。l质量色谱法(mass chromatography,MC)——记录具有某质荷比的离子强度随时间变化图谱。在选定的质量范围内,任何一个质量数都有与总离子流色谱图相似的质量色谱图。
选择性离子监测(selected ion monitoring,SIM)—— 对选定的某个或数个特征质量峰进行单离子或多离子检测,获得这些离子流强度随时间的变化曲线。其检测灵敏度较总离子流检测高2-3个数量级。
GC-MS
接口:由GC出来的样品通过接口进入到质谱仪,接口是色质联用系统的关键。
接口作用:
l压力匹配——质谱离子源的真空度在10-3Pa,而GC色谱柱出口压力高达105Pa,接口的作用就是要使两者压力匹配。
2组分浓缩——从GC色谱柱流出的气体中有大量载气,接口的作用是排除载气,使被测物浓缩后进入离子源。
常见接口技术有:
1分子分离器连接 (主要用于填充柱)
扩散型:扩散速率与物质分子量的平方成反比,与其分压成正比。当色谱流出物经过分离器时,小分子的载气易从微孔中扩散出去,被真空泵抽除,而被测物分子量大,不易扩散则得到浓缩。
2直接连接法(主要用于毛细管柱)
在色谱柱和离子源之间用长约50cm,内径0.5mm的不锈钢毛细管连接,色谱流出物经过毛细管全部进入离子源,这种接口技术样品利用率高。 3开口分流连接
该接口是放空一部分色谱流出物,让另一部分进入质谱仪,通过不断流入清洗氦气,将多余流出物带走。此法样品利用率低。
隔垫:1保持气密性2隔垫漏气是相当常见的故障之一3选择适当的隔垫并适时更换
衬管:1玻璃或石英材质2保护色谱柱3 视状况填入适当填料4不同应用有不同容积与形状需求5定期检查更换
1、衍生化方法
衍生化的目的:增加样品挥发性;减弱样品的吸附活性;柱外或柱上衍生化获得更多的定性信息
衍生化反应的要求:反应最好完全,尤其要保证重现性;反应迅速、步骤少;衍生物稳定;衍生试剂要能从色谱柱上洗脱且与衍生物分离
常见衍生化反应:硅烷化;酯化;酰化
2、质谱谱库和谱图检索
分析复杂样品时可能会出现上百个色谱峰,人工解析既费时又费力,利用谱
图检索有利于顺利、快速解析未知化合物,进行定性分析。
注意:1、EI 70eV;2、纯化合物;3、避免被扫描物质被其他物质干扰;4、匹配度最高的的化合物并不一定是要求的化合物。
3、联用技术的应用
氧化苯甲酰是一种强氧化剂、面粉增白剂,面粉中添加过多一则降低小麦粉的营养价值,二则会危害人体健康,面粉中过氧化苯甲酰是食品质量检测的重要指标。杭州市质量技术监督检测院周敏[1]使用GC-MS法确定苯甲酸,并用选择离子检测方式SIM测定面粉中过氧化苯甲酰的含量,避免GC分析时杂质峰的干扰。
过氧化苯甲酰在酸性条件下被还原为苯甲酸,用GC-MS法测定面粉中的过氧化苯甲酰,其方法较其他方法简单了很多,而且能够通过质谱图直接判断苯甲酸(过氧化苯甲酰)的存在,较之GC更为直观。加之质谱检测器可以选择离子扫描检测,避开样品中的基质干扰,这是GC所无法比拟的。为面粉及其制品中过氧化苯甲酰的测定提供一种简单、准确度高、灵敏度高的方法。
可介绍实验室仪器情况 举例子
4、GC-MS与GC的区别
①GC-MS定性参数增加,定性可靠。
②GC-MS是一种通用的色谱检测方法
③GC-MS 同位素稀释和内标技术,提高质谱仪定量分析精度
④GC中某些检测器需要经常清洗,在GC-MS中最需要经常清洗的是离子源和离子盒(影响仪器工作状态的重要因素)
防止离子源污染的方法:柱老化时不连接质谱仪、减少注入高浓度样品、防止引入高沸点组分、尽量减少进样量、防止真空泄露、反油。
LC-MS
接口和离子源
接口作用:1将流动相及样品气化2分离除去大量的流动相分子3对样品分子的电离。
LC分离需用大量溶剂,如何去除溶剂并使样品离子化是LC-MS联用的关键。早期使用过的传送带接口(MB)、热喷雾接口(TSP)、粒子束接口(PB)、快原子轰击(FAB)等十余接口装置均存在一定的缺点,未得到广泛应用。目前几乎所有的LC-MS联用仪都使用大气压电离源(API)作为接口装置和离子源。API包括电喷雾电离源(ESI) 和大气压化学电离源(APCI)两种。二者都是非常温和的离子化方式区别主要在于大气压下产生气相离子的方式不同。ESI只能用于离子型样品,电喷雾产生气相离子,APCI具有电晕放电针,用于非极性样品。
基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定分子量高达上百万ud的肽类和蛋白质分子,精度可达0.2%,所需样品量一般为50pmol~100fmol。MALDI使肽类和蛋白质进行多电荷离子化,TOF收集多电荷峰,折算得到分子量。
1电离室是圆形,缩小死体积,减少仪器简介:Agilent1100LC-MS系统:○
2采集中交替改变施加在喷口和毛细管之间的高电压极对离子化有害的湍流;○
性,在显示器上显示化合物可能产生的正离子和负离子,方便测定条件的选择优
3自动调谐。 化;○
分析条件的选择优化:1接口2正负离子模式:碱性化合物宜用正离子方式,酸性化合物宜用负离子方式,如未知正负离子都要做,优先选择正离子;3流动
相:甲醇、乙腈、水,离子对试剂尽量不用,必须使用时尽量少量;4流量:条件允许情况下尽量使用小柱径柱子5系统背景的消除:溶剂色谱级,样品纯化,系统清洗,高纯氮
样品制备主要指分离方法,我所熟悉的只有固相萃取:分离、纯化、浓缩、小型化
固相萃取填料一般为经过化学键合的颗粒型硅胶,非极性化合物用非极性填料,极性化合物用极性填料,离子型化合物用离子交换树脂填料。固相萃取前要对被分析物进行提取,然后用固相萃取住进行净化,净化分活化及平衡、上样、淋洗、洗脱、浓缩5步。
联用技术的应用 157 举例子
由被测定的肌红蛋白多电荷离子的价态及质荷比可以计算出其分子量。多电荷的分布形状应该像肌红蛋白的一样,随着电荷的减少由低丰度向高丰度再向低丰度变化。但实际中理想的结果并不多。
人血浆中马拉硫磷的含量测定:在刑事案件中经常遇到有机磷农药的案例,在临床上也常见误服有机磷农药的病例,王贤亲[9]进行了人血浆中马拉硫磷含量的测定,ESI(电喷雾离子源),正离子检测,多反应监测MRM方式定量对马拉硫磷进行检测。使用ESI源LC-MS联用技术分析马拉硫磷,被测物的离子化效率很好,得到了准分子离子峰[M+1]+,灵敏度很高,选择性很好,谱图简单,容易分析,适合于法庭和临床有机磷毒药分析。
LC-MS在药物分析中的应用:
液相色谱/质谱可以获取分子量信息及对未知结构的分析
药物中杂质成份的确定
药物的品质控制
天然产物分析或中草药的品质控制
在药物代谢方面的应用
参考文献
[1] 周敏..气相色谱-质谱法快速测定面粉中过氧化苯甲酰[J].中国卫生检验杂
志,2008,18(12):2563-2564