淡水小球藻异养培养生产叶黄素的研究_马永强

工艺技术

淡水小球藻异养培养生产

叶黄素的研究

马永强，韩春然，孙冰玉

（哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨１５００７６）

摘要：通过单因素实验和正交实验确定了淡水椭圆小球藻异养培养的最佳条件为ＢＧ－１１培养基中葡萄糖浓度为２０ｇ／Ｌ、尿素浓度为１．０ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值为６．５、２８℃，异养培养生产叶黄素的最佳条件为

ＢＧ－１１培养基葡萄糖浓度４０ｇ／Ｌ、尿素浓度０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ值６．５、２８℃下振荡培养８ｄ。关键词：叶黄素；椭圆小球藻；异养培养中图分类号：ＴＳ２０２．３

文献标识码：Ａ

文章编号：１００５－９９８９（２００７）０５－０１３２－０３

ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｕｔｅｉｎｂｙｔｈｅｍｉｃｒｏａｌｇａＣｈｏｒｅｌｌａｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａｉｎ

ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ

ＭＡＹｏｎｇ－ｑｉａｎｇ，ＨＡＮＣｈｕｎ－ｒａｎ，ＳＵＮＢｉｎｇ－ｙｕ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨａｒｂｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｍｍｅｒｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ１５００７６）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙｔｈｅｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒＣｈｏｌｅｒｒａｅｌｌｉｐｓｏｉ－ｄｅａｉｎｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｗｅｒｅ：ＢＧ１１ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ２０ｇ／Ｌｇｌｕｃｏｓｅａｎｄ１．０ｇ／Ｌｕｒｅａ，ｏｒｉｇｉｎａｌｐＨ６．５，２８°Ｃ，ａｎｄｌｕｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ：ＢＧ１１ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ４０ｇ／Ｌｇｌｕｃｏｓｅａｎｄ０．２ｇ／Ｌｕｒｅａ，ｏｒｉｇｉｎａｌｐＨ６．５，２８°Ｃ，８ｄａｙｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｕｔｅｉｎ；ｃｈｏｌｅｒｒａｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ；ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ

叶黄素（Ｌｕｔｅｉｎ），又名“植物黄体素”，是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果等高等植物与某些藻类

收稿日期：２００６－１０－１３

作者简介：马永强（１９６３－），男，哈尔滨人，硕士，教授，研究方向为食品生物化学以及食品酶学。

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四卷）［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８８：１４７［６］陈世伟，李俊峰，等．槲寄生碱的提取纯化及抗肿瘤研究．

山东中医药大学学报，２００１，２５（５）：３７３－３７５

［２］［３］

孙艳秋，刘珂，王守愚，等．槲寄生的研究进展［Ｊ］．中草药，

２０００，２３（６）：４７１－４７１

ＢｅｒｅｔＡ，ＣａｚｅｎａｖｅＪＰ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎｂｌｏｏｄ－ｖｅｓｓｅｌｗａｌｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌａｎｔｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９８８，１１：１８７－２００

［４］杨红，等．中药化学实用技术［Ｍ］．北京：化学工业出版社［５］ＺｈｕＱＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄα－ｔｏｃｏ－

ｐｈｅｒｏｌｉｎｈｕｍａｎｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，（１１）：１４－２１

１３２

Ｎｏ．５．［７］李晓斌．槲寄生提取物的抗衰老实验研究［Ｊ］．云南中医院

学报，２００ｌ，２４（１）：ｌ３－１４

［８］卢艳花．中药有效成分提取分离技术［Ｍ］．北京：化学工业

出版社，２００５

［９］尉芹，王冬梅，等．杜仲叶黄酮含量测定方法研究［Ｊ］．西北

农林科技大学（自然科学版），２００１，２９（５）：１９９－１２２

［１０］李云雁，等．试验设计与数据处理［Ｍ］．北京：化学工业出版

社，２００５

工艺技术

生物中的天然色素［１］。除了被广泛作为色素使用之外，叶黄素还具有重要的生理功能，如它具有抗氧化功能［２］，对老年性眼球视网膜黄斑退化引起的视力下降和失明有预防的效果［３］，对心血管疾病、白内障以及癌症的治愈也都有明显的功效［２］。美国“食品与药物管理局”在１９９５年批准叶黄素可以作为食品补充剂。叶黄素的生产有从植物中提取和利用微生物发酵两种方法，在我国，以前一种为主。

小球藻为绿藻门小球藻属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）普生性单细胞绿藻，是单细胞的真核生物。它体积小，以光合自养生长繁殖，分布极广，生物量大［４］。对生长条件要求简单，环境耐受性强，繁殖速率高，人工培养比较容易。同高等植物相比，利用藻类生产叶黄素更有优势，因为藻类可以大规模的利用生物反应器来培养，因此可以使产品来源持续而稳定。本文目的旨在研究利用淡水椭圆小球藻异养培养来生产叶黄素的方法，为小球藻的开发提供科学依据。１１．１

材料与方法材料

（见表１）进行小球藻异养培养的正交试验（接种量１０％，培养８ｄ）。

表１

小球藻异养培养优化因素水平表

因素

水平温度（℃）葡萄糖浓度（ｇ／Ｌ）

尿素浓度（ｇ／Ｌ）

ｐＨ值Ｄ５．５６．０６．５

Ａ

１２３

２６２８３０

Ｂ２０３０４０

Ｃ０．２０．６１．０

小球藻异养培养条件的确定：分别以血球计数法测定各发酵液中的细胞数量，以细胞数量为指标，确定小球藻异养培养的最佳条件。

小球藻异养培养生产叶黄素条件的确定：藻粉的制备：分别收集各培养条件得到的培养液，６０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ，弃去上清液，收集藻泥，于真空冷冻干燥器中干燥，将干燥后的藻体用研钵磨碎成藻粉，过６０目筛，放入密封容器中，－１８℃保存。

叶黄素的测定：准确称取０．１ｇ藻粉，加入一定体积的有机溶剂［６］，用细胞破碎器破碎，探头转速１００００ｒ／ｍｉｎ、破碎次数２次、破碎时间５ｍｉｎ／次、室温，将处理后的溶液于６０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ，收集上清液，定容，于４４５ｎｍ下测定溶液的吸收值，以吸光光度（ＯＤ）值表示叶黄素的相对含量。

小球藻生产叶黄素条件的确定：在上述正交条件下，以各培养条件下叶黄素的ＯＤ值为指标，确定小球藻生产叶黄素的最佳条件。

淡水椭圆小球藻（Ｃｈｏｌｅｒｒａｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）：宁波大学藻类研究所；ＢＧ－１１培养基［５］。１．２

主要仪器设备

７２２光栅分光光度计，气浴恒温振荡箱，高速离心机，真空冷冻干燥机，ＰＢ－１０ｐＨ计。１．３

实验方法

１．３．１影响小球藻生长因素范围的确定使用ＢＧ－１１

培养基，培养基中与考察因素有关的原始条件为葡萄糖１０ｇ／Ｌ、尿素０．２ｇ／Ｌ、自然ｐＨ。其他条件为接种量１０％，培养基装液量１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶，２８°Ｃ恒温摇床培养８ｄ。将小球藻分别在下列条件培养后，用血球计数法测定各培养液中细胞数量。

温度：将淡水小球藻接种到原始ＢＧ－１１培养基中，恒温摇床培养温度分别为２０℃、２５℃、２８℃、３０℃、３５℃。

葡萄糖浓度：将上述ＢＧ－１１培养基中葡萄糖的浓度分别为０、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ，其他条件不变。

尿素浓度：将上述ＢＧ－１１培养基中尿素的浓度分别为０、０．２ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ，其他条件不变。

培养基起始ｐＨ值：将ＢＧ－１１起始ｐＨ值分别调节为３．５、４．５、５．５、６．５、７．５，其他条件不变。１．３．２淡水小球藻异养培养的正交实验在已确定的上述各单因素的适宜范围内，选定３个水平，利用Ｌ９（３４）

２２．１

结果与讨论

影响小球藻生长的各因素范围的确定

２．１．１温度

从不同培养温度下淡水小球藻的细胞数量来看（见图１），在２５～３０℃之间，藻体生长较好，３０℃以后，藻体生物量急剧下降。因此，异养培养温度范围可选择在２５～３０℃之间。２．１．２葡萄糖浓度

在葡萄糖浓度低于２０ｇ／Ｌ时，淡水小球藻的细胞数量随葡萄糖浓度的增加而增加，在葡萄糖浓度为２０～３０ｇ／Ｌ时达到最高值，在４０ｇ／Ｌ以前，细胞数量比

２００７

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工艺技术

Ａ２Ｂ１Ｃ３Ｄ３，，即２８℃、ＢＧ－１１培养基中葡萄糖浓度为２０ｇ／Ｌ、尿素浓度为１．０ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值为６．５。２．３确定

淡水小球藻异养培养生产叶黄素最佳条件的

在正交实验的条件下，异养培养淡水小球藻，得到的叶黄素的吸光光度值见图５。在９个摇瓶中，６号摇瓶（培养条件为２８℃、葡萄糖浓度为４０ｇ／Ｌ、尿素浓度为０．２ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值为６．０）叶黄素在４４５ｎｍ

较稳定；当葡萄糖浓度超过４０ｇ／Ｌ时，提高葡萄糖浓度会导致藻细胞数量下降（见图２），这说明，碳源浓度过高会对淡水小球藻的生长产生抑制作用。因此，葡萄糖的浓度范围为２０～４０ｇ／Ｌ。２．１．３尿素浓度

下的ＯＤ值最高。

直观分析表明，各因素对小球藻异养培养条件下发酵生产叶黄素的影响顺序是温度＞尿素浓度＞葡萄糖浓度＞ｐＨ值。最优组合应为Ａ２Ｂ３Ｃ１Ｄ３，即２８℃、葡萄糖浓度为４０ｇ／Ｌ、尿素浓度为０．２ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值为６．５，与６号摇瓶的实验条件非常接近。

由图３可见，尿素浓度低于０．６ｇ／Ｌ时，增加尿素浓度会促进小球藻的生长；在０．２￣１ｇ／Ｌ之间，小球藻的生长比较稳定；而超过１ｇ／Ｌ时，小球藻的细胞数量明显降低。说明尿素是小球藻生长所必需的，但高浓度的尿素会抑制藻细胞的生长，适宜的尿素浓度可取范围为０．２～１ｇ／Ｌ。２．１．４培养基起始ｐＨ

３

结论

淡水小球藻异养培养的最佳条件是ＢＧ－１１培养基中葡萄糖浓度２０ｇ／Ｌ、尿素浓度１．０ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值６．５、２８℃培养，而其产叶黄素的最佳条件则为葡萄糖浓度４０ｇ／Ｌ、尿素浓度０．２ｇ／Ｌ、培养基初始ｐＨ值６．０、２８℃培养。说明淡水小球藻异养培养与其生产叶黄素的条件并不完全一致，高浓度的尿素有利于菌体的增值，而高浓度的葡萄糖有利于叶黄素的积累。

参考文献：

［１］杨丽飞，邓宇．叶黄素提取工艺的初步研究．广西轻工业，

２００３，（６）：１２－１５

［２］李浩明．万寿菊叶黄素及其生理功能研究概况．中国食品

添加剂，２００１，（１）：３１－３３

一般来说，小球藻存活的ｐＨ范围为４．５～１０．６，接近中性的ｐＨ有利于小球藻的生长。本实验中，小球藻在初始ｐＨ３．５～７．５的范围内都能生长，但在ｐＨ５．５～６．５内，藻细胞数量维持在一个较高值（见图４）。由此认为，小球藻异养培养适宜的ｐＨ范围为５．５～６．５。２．２

淡水小球藻异养培养条件的确定

［３］ＣｈｅｎＦ，ＳｈｉＸ，ＪｉａｎｇＹ．Ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｕｔｅｉｎｂｙｔｈｅｇｒｅｅｎｍｉｃｒｏａｌｇａＣｈｌｏｒｅｌｌａｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓｉｎｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ，７２３－７２７

ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，２００２，（１８）：

［４］［５］

孙勇如．小球藻—新型的生物反应器［Ｎ］．科学中国人，

２００２，（４）：３９

潘欣，等．小球藻异养培养的研究．食品科学，２００２，２３（４）：

正交实验的直观分析结果表明，各因素对异养培养条件下小球藻的生长的影响顺序是：温度＞＞葡萄糖浓度＞ｐＨ值＞尿素浓度。最优条件组合应为

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Ｎｏ．５．２８－３３

［６］桂林．蛋白核小球藻培养方式的比较及其叶黄素的提取

检测．华中农业大学图书馆，２００１