菌种保存与活化

菌种保存与活化

（一）培养基保存法

利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。

1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。经35℃培养18～24h后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月，

每月传代一次。

2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐

延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。

3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。

4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。

5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以

无菌方法加入灭菌的液体石蜡。高度约lcm，置4℃冰箱保存。保存时间可达3～6个月。

（二）干燥保存法

原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。菌

种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。

（三）冷冻干燥保存法

本法又称冷冻真空干燥法。它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年，

有的可长达10年以上。

菌种保管要求

2009-11-16 15:32

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1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。液体培养基不适于保存菌

种。

2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初

次分离的流感嗜血杆菌需保存于37℃孵箱中。

3.保存菌种应做鉴定记录。在主要培养基上生长情况、菌落特征、形态及革兰染色或特殊染色反应、

生化反应、血清学性状以及个别菌种需要的动物试验结果等。

4.保存的菌种应有两套，一套供保存传代用，一套供实验用。

5.定期转种，每转种三代作一次鉴定医学教|育网搜集整理。

6.专人保管和发放，严格保管和发放制度。

菌种保藏技术

菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。

一、菌种保藏原理

菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。

二、菌种保藏的方法

1、低温定期移植保藏法。将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。

2、液体石蜡保藏法。取化学纯液体石蜡（要求不含水分、不霉变）装于三角瓶中加棉塞并包纸，在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时，再放入40℃恒温箱中数天，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28-30℃下培养2-3天，证明无杂菌生长方可使用。然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待保藏的斜面试管中。注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。保藏时间在一年以上，在低温下，保藏时间还可延长。

3、沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2-4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的ph达到中性，烘干备用。同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将处理好的沙与土以（2-4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5-2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2-3小时）1-2次，进行无菌检验，合格后使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2-10年。

4、滤纸片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4×0.8厘米的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟）。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸

条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，再将保藏试管放入干燥器中1-2天，除去滤纸水分，使滤纸水分含量达2%左右，然后低温保藏。

5、自然基质保藏法

⑴麦粒保藏法：取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净，浸泡12-15小时，加水煮沸15分钟，继续热浸15分钟，使麦粒胀而不破，沥干水分摊开晾晒，使麦粒的含水量在25%左右。将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙、石膏比例为10公斤:133克:33克），拌和均匀后装入试管中，每管约2-3克，然后清洗试管，塞棉塞，灭菌1.5（1.5公斤/平方厘米，2小时），经无菌检查合格后备用，试管基质冷却后接种，适温培养，待菌丝长满基质后用石蜡涂封棉塞，放低温保藏。2年左右转接一次。

⑵麸曲保藏法。取新鲜麸皮，过60目筛除去粗粒。将麸皮和自来水按1:1拌匀，装入小试管，每管约装1/3高度，加棉塞用纸包扎，高压灭菌（1.5公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将生长在斜面培养基上的健壮菌种，移种至无菌麸曲管中，移种时注意尽管捣匀小试管中的麸皮，呈疏松状态，在适温下培养至菌丝长满麸皮为止，将麸曲小管置干燥器中，在低温或适温下保藏。

6、生理盐水保藏法。取纯氯化钠0.7-0.9克，放入100%毫升蒸馏水中，搅拌均匀分装试管，每管5-10毫升，进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天。无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中，塞上无菌橡皮塞，用石蜡涂封，在室温或低温保藏。

7、冷冻真空干燥法。将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶制成菌悬液，将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安瓿瓶中，每管约0.3-0.5毫升，然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接，安瓿瓶放在冷冻槽中于-30℃至-40℃迅速冷冻，并在冷冻状态下抽空干燥，并在真空状态下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本较高。

8、液氮超低温保藏法。首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次，准备安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液，塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米，5分钟）。无菌检查后，接入要保藏的菌种，火焰熔封瓶口，检查是否漏气，将封好口的安瓿瓶放在冻结器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至-35℃，以后冻结速度就不需控制，安瓿冻结后立即放入液氮罐内，在-150至-196℃保藏，该法只有少数科研院所使用。