11双水相萃取技术在植物SOD提取纯化中的应用
２００８年第６期
中国食物与营养Food and Nutrition in China
Ｎｏ．６，２００８
双水相萃取技术在植物ＳＯＤ提取纯化中的应用
吴
夏，王
摘要：利用ＰＥＧ－磷酸盐双水相萃取法对多种植物ＳＯＤ进行提取研究以求最佳提取条件。考察影响因素包括
ＰＥＧ分子量、ＰＥＧ含量、ｐＨ值、温度等。ＳＯＤ提取物活性检测采用３２５ｎｍ微量邻苯三酚自氧化法，并对提取到的植物ＳＯＤ进行了型别鉴定和分子量测定。确定最佳萃取条件为：相组成为１２％ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐；ｐＨ ７．０；温度为４５℃。三种植物中库拉索芦荟ＳＯＤ的活性回收率最高，采用最佳萃取条件可达８７．２％，故大规模提取植物ＳＯＤ的原料优选为库拉索芦荟。可见双水相萃取技术可以完全代替传统ＳＯＤ提取方法，具有工艺简单，毒性小，成本低等优点。
关键词：双水相萃取；聚乙二醇；磷酸盐；植物；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）是一类广泛存在于生物体内的氧化还原酶。ＳＯＤ的研究和应用已受到广泛重视［１］。目前，国内外食用药用ＳＯＤ大多从动物血中提取，以植物为原料大规模提取ＳＯＤ的技术尚未成熟。
经对已有文献研究发现，大蒜［２］、库拉索芦荟［３］、金琥仙人球中含有较丰富的ＳＯＤ，因此我们以这三种植物为原料，探索从植物中提取ＳＯＤ的方法。
目前已有文献报道从仙人掌中提取ＳＯＤ［４］，但尚未有从金琥仙人球中提取ＳＯＤ的实验报道。
ＳＨＧ ２６２型多功能粉碎机（宁波市舜辉电器有限公司），ＴＧＬ－１６ｃ型离心机（上海安亭科学仪器厂），ＳＵＰＥＲ Ｔ２１型冷冻离心机（美国科峻Ｋｅｎｄｒｏ仪器公司），ＤＨＧ－９１４０Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。
２
２．１
实验方法
植物ＳＯＤ粗提液的制备
植物原材料均经过蒸馏水荡洗，切成小块，放入多
功能粉碎机粉碎，所得匀浆液经双层纱布过滤两次，合并滤液并离心１０ｍｉｎ（４０００ｒ／ｍｉｎ，室温），取上清液并在６０℃水浴下热变性１５ｍｉｎ，冷冻离心１０ｍｉｎ（８０００ｒ／ｍｉｎ，４℃），取上清液，用透析袋动态浓缩除杂，即得植物ＳＯＤ粗提液。由于大蒜植物本身汁液较其他两种植物少，因此在粉碎时需要加入ＰＢＳ缓冲液作为提取溶剂，以提高提取效果。
２．２ＰＥＧ－磷酸盐双水相体系的建立
将ＰＥＧ和磷酸盐（Ｋ２ＨＰＯ４和ＫＨ２ＰＯ４按比例组成）分别制成一定浓度的溶液，准确量取一定量ＰＥＧ溶液置于试管中，加入磷酸盐溶液，混合至试管开始出现混浊为止，离心分离或静置２ｈ分离成相即可得到ＰＥＧ－磷酸盐双水相体系，根据加入的ＰＥＧ和磷酸盐溶液的量，算出ＰＥＧ和磷酸盐及水在系统中的质量百分浓度。
１
１．１
实验材料
材料
江苏海门产大蒜，购于江苏省海门市农贸市场；
库拉索芦荟、金琥仙人球，购于江苏省南京市金陵花卉市场。
１．２试剂与仪器
ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００（广东光华化学厂有限公司），ＰＥＧ６０００、ＰＥＧｌ００００（南京助研生物技术有限公司）；
Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｇ２５０试剂盒（南京建成生物工程研究所）；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ标准蛋白：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒ－ｋｅｔ（宝生物工程有限公司）；
其余试剂为化学纯或分析纯。
。
４４中国食物与营养
２．３双水相萃取方法
按照上述成相条件，配制高浓度的ＰＥＧ和磷酸盐的备用溶液，用移液枪向刻度试管中加入一定量的ＰＥＧ溶液和磷酸盐溶液，再加入２ｍｌ植物ＳＯＤ粗提液，然后加双蒸水至１０ｇ，充分混合，静置待上下分相。２．４酶活的测定
采用３２５ｎｍ邻苯三酚ＥＤＴＡ微量法。反应总体积为３ｍＬ，其中２．９８ｍＬ为含１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的ｐＨ ８．２，５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液；０．０１ｍｌ为１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣＩ溶液；０．０１ｍＬ为５０ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚溶液。空白对照管以０．０１ｍＬ的１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液代替０．０１ｍＬ的邻苯三酚溶液。ＳＯＤ样品管以０．０１ｍＬ的ＳＯＤ溶液代替０．０１ｍＬ的１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液。２．５蛋白质含量测定
采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｇ２５０试剂盒进行测定。２．６
ＳＯＤ型别的鉴定
根据文献［６］，Ｍｎ－ＳＯＤ对氰化物和过氧化氢均不敏感，Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ对氰化物和过氧化氢均敏感，Ｆｅ－ＳＯＤ对氰化物不敏感，用这两种抑制剂进行实验，将３类ＳＯＤ分开。
２．６．１Ｈ２Ｏ２对ＳＯＤ活力抑制取４只洁净试管，各加入１．５％Ｈ２Ｏ２ １５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ及适量ＳＯＤ酶液，于３０℃水浴恒温３０ｍｉｎ，取出迅速冷却至２５℃，测定酶活力。并以重蒸水中酶活力为基准，计算其相对活力。２．６．２
ＫＣＮ对ＳＯＤ活力抑制
取６只洁净试管，各加入
表１
ＰＥＧ分子量
ＰＥＧ
１０００４０００６０００１００００
＊
１０ｍＭ ＫＣＮ １００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ及适量ＳＯＤ酶液，于３０℃水浴恒温３０ｍｉｎ，取出迅速冷却至２５℃，测定酶活力，并以重蒸水中酶活力为基准，计算其相对活力。２．７
植物ＳＯＤ的分子量测定
按照常规操作，采用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳法［７］。
３结果和讨论
３．１ＰＥＧ分子量的确定
实验采用ＰＥＧ－磷酸盐双水相萃取体系。不同分子量ＰＥＧ构成的双水相体系的疏水性不同。因为在相同浓度的溶液中，当ＰＥＧ分子量增加，即分子链的长度增加，其所包含的羟基减少，所以增加了溶液的疏水性；另一方面，ＰＥＧ分子链的增长，可以造成溶液自由体积的减小，结果会造成蛋白质溶解度下降。因此，ＰＥＧ的分子量是本实验重要的参数之一［５］。Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ４是生物相容性较高的缓冲体系，对于蛋白质类易失活物质的双水相萃取分离具有一定优势。
据参考文献［８］，张尔贤等已经考察过不同磷酸盐浓度对双水相萃取效果的影响，故本实验采取固定磷酸盐含量（２４％Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ４磷酸盐缓冲液），变化ＰＥＧ的分子量和含量；固定体系组成，变化ｐＨ、温度等方法来确定最佳提取条件。
备选ＰＥＧ的分子量为：１０００、４０００、６０００、１００００。
不同分子量ＰＥＧ对ＳＯＤ活性的影响
相比
大蒜
１．１２ ０．９５ ０．９３ ０．８９
５３．２ ７１．１ ６８．３ ５９．５
＊
下相ＳＯＤ活性回收率（Ａｂ％）
相组成（ｗ／ｗ％）
磷酸盐（ｐＨ６．５）
２４ ２４ ２４ ２４
芦荟 ６５．４ ７４．１ ７０．９ ６１．３
仙人球 ５１．８ ７０．３ ６９．２ ５５．７
１５ １５ １５ １５
下相ＳＯＤ活性回收率（Ａｂ％）＝下相ＳＯＤ活性／两相总ＳＯＤ活性
由表１知，对于不同萃取体系，三种植物中芦荟Ａｂ％普遍较高；而对于不同的植物ＳＯＤ，ＰＥＧ－４０００萃取得到Ａｂ％普遍较高。
故本实验双水相萃取体系确定为：ＰＥＧ－４０００－磷酸
表２
ＰＥＧ质量分数下相活力回收率（Ａｂ％）下相蛋白回收率（Ｐｒ．ｂ％）
＊
＊
提纯率（Ｐｘ）
＊＊
盐；确定萃取体中ＰＥＧ－４０００最佳含量时，采用芦荟ＳＯＤ为萃取对象。
３．２采用２４％磷酸盐（ｐＨ６．５）和不同百分比ＰＥＧ－４０００
的双水相萃取结果
２４％磷酸盐（ｐＨ６．５）和不同百分比ＰＥＧ－４０００的双水相萃取结果
８ ６２．８ ５８．９ １．０６
１０ ７２．０ ５７．１ １．２６
１２ ７８．３ ５５．１ １．４２
１５ ７２．９ ５３．６ １．３６
１８ ６３．１ ４９．２ １．２８
２０ ５２．７ ４１．５ １．２７
２５ ３０．４ ３１．７ ０．９５
３０ ８．９ １４．５ ０．６１
下相蛋白回收率（Ｐｒ．ｂ％）＝下相蛋白含量／两相总蛋白含量
提纯率（Ｐｘ）＝下相活性回收率（Ａｂ％）／下相蛋白回收率（Ｐｒ．ｂ％）
吴夏等：双水相萃取技术在植物ＳＯＤ提取纯化中的应用
１００
ｐＨ
８０回收率（％）
６０４０２０００
５
１０
１５
２０
２５
３０
３５
回收率（％）
顶部上相相界面下相底部
４５
表４
５．５ ＋ ＋ ＋＋ － ＋
不同ｐＨ条件双水相萃取现象
６．０ ＋ ＋ ＋＋ － ＋
６．５ ＋ ＋ ＋＋ － ＋
７．０ ＋ ＋ ＋＋ － ＋
７．５ ８．０ ８．５ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ － － － ＋ 晶体 晶体
注＋：混浊或沉淀（不溶物）＋＋：致密沉淀－：澄清
１００８０６０４０２００５
５．５
６
６．５７ｐＨ值
７．５
８
８．５
９
ＰＥＧ－４０００质量分数（％）ｂ％）图１
ＰＥＧ－４０００含量对植物ＳＯＤ的双水相萃取结果的影响
由图１表２可知，不同含量ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐双水相中，当ＰＥＧ含量为１２％时，Ａｂ％达最大值。当ＰＥＧ含量从１２％增至３０％时，Ａｂ％随含量增加而下降，当ＰＥＧ含量超过２０％时，Ａｂ％下降更为迅速。同时，Ｐｒ．ｂ％也具下降趋势，但下降速率小于Ａｂ％。通过计算，提纯数在ＰＥＧ－４０００含量为１０％～１５％之间出现较高数值，并在１２％达到最大。
综合表２三项因素考虑，双水相萃取系统最佳组成为：１２％ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐。３．３
表３
ｐＨＡｂ％Ｐｒ．ｂ％Ｐｘ
ｂ％）图２
不同ｐＨ条件下双水相萃取结果
表３、图２表明了固定双水相组成（１２％ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐），只改变ｐＨ，然后测定Ａｂ％、Ｐｒ．ｂ％，计算Ｐｘ的变化情况。结果发现在ｐＨ＝５．５～８．５，Ａｂ％峰值出现在ｐＨ７．０处。对比之下，Ｐｒ．ｂ％的起伏较小，当ｐＨ６．５时，Ｐｒ．ｂ％达最大值。而１２％ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐（ｐＨ７．０）的双水相配比，使得提纯率（Ｐｘ）提高了近１倍。因此确定ｐＨ７．０为最佳ｐＨ条件。３．４温度对萃取结果的影响
固定ＰＥＧ－４０００的百分含量为１２％，磷酸盐为２４％，ｐＨ７．０，考查温度对萃取结果的影响。烘箱控制萃取温度。
ｐＨ对萃取结果的影响
ｐＨ对１２％ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐双水相萃取的影响
５．５ ０．１ ０．３ ０．３３
６．０ １０．６ １２．０ ０．８８
６．５ ６９．３ ４９．１ １．４１
７．０ ７．５ ８５．１ ５６．９ ３１．４ ２１．９ ２．７１ ２．６０
８．０ ４５．９ １８．６ ２．４７
８．５ ６５．１ ３３．２ １．９６
表５
温度（℃）Ａｂ％Ｐｒ．ｂ％Ｐｘ
２０ ５６．９ ２３．３ ２．４４
温度对１２％ＰＥＧ－４０００－２４％磷酸盐（ｐＨ ７．０）双水相萃取的影响
２５ ６３．１ ２３．１ ２．７３
３０ ７８．４ ２８．５ ２．７５
３５ ８３．９ ２９．０ ２．８９
４０ ８６．６ ２９．２ ２．９７
４５ ８７．２ ２２．９ ３．８１
５０ ８５．１ ２２．８ ３．７３
５５ ６９．４ ２０．４ ３．４０
６０ ４９．７ １５．１ ３．２９
６５ ３１．３ １１．７ ２．６７
７０ １５．５ ７．９ １．９６
由表５图３可知：芦荟ＳＯＤ最适温度为４０～５０℃，在５５℃以上活性急剧下降。通过计算比较Ｐｘ，发现温度为４５℃时可达最大提纯率。
３．５植物ＳＯＤ性质的鉴定结果（表６）
表６
植物芦荟大蒜仙人球
３．６讨论
植物ＳＯＤ经过冷冻离心后得到的上清液浓度较小，且ＰＥＧ与磷酸盐对ＳＯＤ活力均有影响，应尽量除去，采用流动透析３０ｈ可达到以上双重目的。
实验发现，ｐＨ对植物ＳＯＤ在双水相中的分配有明显影响：当选用ｐＨ７．０的双水相进行萃取时，ＳＯＤ活性回收率达峰值，而蛋白回收率下降，导致此ｐＨ条件下提纯率最大，说明此时ＳＯＤ在下相的溶解能力强于杂蛋白。
本实验得到的植物ＳＯＤ虽然纯化倍数不高，但是蛋
不同植物ＳＯＤ性质鉴定结果
型别 Ｆｅ－ＳＯＤ Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ
蛋白质分子量（ＫＤａ）
２１．７ ２６．６ ３６．２
４６
１００９０８０７０６０５０４０３０２０１００
中国食物与营养
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２０
３０
４０
５０
６０
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温度℃
ｂ％）图３
不同温度下的双水相萃取结果
白活性回收率较高，且不需低温环境操作，成本较传统的ＳＯＤ分离纯化方法更为低廉，所以，双水相萃取技术可以为大规模工业化生产植物ＳＯＤ提供更佳选择。◇
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