HPLC测定他达拉非中的对映异构体和非对映异构体

HPL 测C定他达非拉中的对异映构和体非映对异构

体

靖 雅，丽敏 王，a杜诗琦 ，a李 a，博狄 a,b斌(*中药国大科，a学药学院，b..药质量物安与全警教育预部点重实室，验南京

a

210009

)

摘 要 ：目 的建 立他达 拉 非 原 料药 中 对 映 异 构 体和 非 对映 异构 的体 定量 分析 方 法 。方 法 采 CH用RIAPAKL-CI( 52 0m×m46 mm，.5μ )色m柱，谱动相流为腈-水乙(4∶00)，流6速 为10.m L·min1，测检长波为22 n2m柱温为 30， ℃ 进，样量 0 2μ。加校L因子的自正稀身对释法照计算异构含体量其中异构，体A 、异体构 和异构B体C 的校 因正子分为 别.12，12.0 7和1.25。 结 他果达非拉及构体异A 异、体构B 和 异构 C体 峰分良好离分离，度>.5，1构体 异、异构体A 和异B构体C 别在 2分.5~37395，.5.6~37095.50，4.~37.8 ng0m·1L内 线性系关好(r良 为0.99 730.9~98 7，)样加回率分别收为 17.05%9，.6%998.5%(，n9)，=样精密进度R S≤D%，2复性重RS D别为 1.分4%，1.64%和4 48.%9检。测分限别为1 2.， 72.5，325.2 g·nm1L 。 3批样中品异构体 A 高最含为量0.0 1%，8 异体构 B及构异体C 均超过未检限测(0

D2eetmrinaton oi fEnnaitmerso nadD aiseterosimeors in Taaladfil yb HLP CJIG YaaN ,WAN GiLinam,D USh qiai,L I Bao, D BiIn,a*(bChni Paarmhaeuctiac lnUviersti,y .Coalegel f Poharamcy,

b.eKyL abortaryoof D ru Qgaluity Cotron aldn Parmachoigilance,v inisMtyr of Eudctaino ,aNningj2100 9, 0China)ABSTRACT O:JEBTIVEC To devlope an HLP mCethod or fteh deetmrintaon io feannitmersoa nd idasereotiosmes ri nadtlaafi. lMEHODTS CHARIAPLA-ICKc oumln250 mm(×.4 m6m ,5 mµ w)saa dpteo. Tdhe moblei pahs wae scaeonttiile-wrtaer40∶(6)0 tat he lfo rawet o f.0 1Lmmin· and1 ijnectin voolue om 20f .L hTe U-Vedecttion wavelngte hwsas t eta2 2 2nmwi t the chluom temnepartre uo 30f℃ T.e hsomei crnotnte serw ceacllatedu b sylef onctart msehtdow tih the orrcecton facior,t andt h eorrcctione acftr oo fsoierm A ,soime Bra d nsomireC we e r.212 1,0.7an d .15 2repscetiely. RESUvTLSCa ilbraiot nurvescwe ref ond to ub einlae in rhe trnges ao 2f.53379.5 g·nLm1 for ismoer A,5 .6039.5 7gnm·L1 fo riomsr Beand 5.4038.7 ng·0m1Lfo ris mer Co(=r.097 930.998 )7.T e hvaeagr ercevoer(y=9)n o fiomsreA, is oer m, Bna diosmreC weer 071.5%,9 .69,%and 89.5,%res pecitvlye RS. oDfre eapatbiityl wa s14.%4 1.64%, na 4.89% dersepcively,ta dnthe SDRo famsplin gprcesioin ws ≤a%.2 hT LeD Oofi soemr A i,omsreB a n isomed Crw ee 1r.27,25 3. 25., n2g

·mL. Isomer 1 Ban Cd wee notr dteceet (d

他s拉非，达学名为化： 6R-(2a1R-6)-1,3(-苯 二并茂恶 -5 基 -)--2 基 -甲2,3,6,7,1,212-a 氢化吡嗪并六 1[','-2,1]6 吡啶并- [,34-]b 吲哚 1-4-,二 酮分，子： C式22H19NO3，4对相分子质：量83.94。他达1非片 拉是磷环酸苷(c鸟MG)特P异磷酸二酯酶性5 (PED-5 )的选择可性抑逆剂制，能异性的抑制 P特D-5E ，主要用现治于勃起疗功能障(碍eercitledys unfctio， nDE)。相对于目前临使用的 PD床-E 抑制剂5，他达 拉 非半的衰更长 ，心血期安全性管好，会不加增心血 事管的风险件及以重程严度具有，良的好 安性全耐受性 。和另外，PDE5- 制抑剂可有效还治作

者介简：靖雅，女，硕 士 生Te:l 5151180529 (720)582713361E -mila :[email protected].[2

]1[

]疗

动脉肺高，能够提压高患者的动运量、生活 质耐量和存生[率3]此；，他外拉非还能够抑制达性 缺氧急性血肺收缩，管制低氧抑诱的导肺脉表动肿 瘤达坏死因，子治在疗缺性 PH 氧面方，其比他2 种 PE-D5 制抑剂地西那非和伐那非有地一优势定4[；] 代谢综对合征物模型动研究的发中现，他达非拉 能够减少脏内肪脂蓄，提积高岛素的胰敏性感5[]。 他拉达非分子的结中有 2 构个性中手，光 学心异体构包他达括拉非异、构 体、异构A B 和 体异构体 C，结构图 1。见达拉他异非构体 B 和异 体构C 为 达他拉非的映对异构和非体映异对体构

*。

Em-al: [email protected]

通作信：者 狄斌，，博男士，教，授博

导elT:·89·

中国现代应用学 2药10 7 年1月第 34卷 第 期1

Chn iJ Mo dppAl haPrm 2,017J auarny V,l.o3 4N.o

1们它 P对DE-5几乎没 有抑作用，而他达拉非制 的对映非异构-异体体 构 对 ADE-P 具5有一定的选 性择抑制作用 ，药典 将达拉他的非异构体各列杂 为质，对其进需行究研控制与。而已道的报献文 为多他达拉做为非法非加添的物定， 如裘测婧一等[

7][6 ]

相为正己烷

-异丙醇统。系一面方他，达拉在这非种非 性流动极相中溶的性较差解；另一面，正 己烷和方异丙价格较高，易醇发且挥极燃易，且 对环境有并，对人体有刺害作激。用因此开一发个流动相为反相系统的方法，不仅 样在系品统中 溶解的更度好，还能降够低分析成本减少对环境， 人体和的害。另外伤采反相流动相系用研统究他 达拉非异构，还可适用体于 L-MS C系统能扩， 大析方分法应用。

的采

用 ULCPQ TOF-M- S测保健定中西地品那类 非物似

，对他达拉非的构异的体测定文的报献较 道少欧洲药典。 和美国典药对 达拉他的异构非 体异构及体A 的析方分法使均手性用色柱，流谱动

8] [[]

图9 1他拉非达、异构体 、异A体 B 和异构体 构C结构 图F ig .1S tucrute orft dalafil,a simeo r,A iosem Br ad inomser

C

1

仪

器试与 1药602 液色相谱仪(美 Ag国ilet 公n司； A)gilen

t.2.22

供试

溶液

品精密取他达拉称供非试品

2

5 mg， 1置00 m L瓶中量，加乙 腈04m 溶L， 用解水释稀定容，匀，摇为供试品作液。 溶.22.3 0.%自1身释对照溶液稀 密量精他取拉达非供 试品液 溶1 Lm置，1 00m 量L中瓶，加腈 乙4 0m，L用稀释水定容摇匀，，作自身稀释为对照 备储；精液密取 量1mL， 置 0 mL 1瓶量，中加乙腈 4 m ，用水稀释L容定摇匀，，为作0 1%.自身稀释对 溶液。 2.照 测3定 精密法量取2“2.3.”下 0.1项%自身释稀照溶 对液2 μL0注，液入色相仪谱记录色谱，，调节图 检测灵度，使主敏的峰高约为满量峰的 2程%0再 精；密取“量.22项下供试”品溶与 液0.1自%稀身释 照对液各溶2 0 Lμ分别注，入液色谱相仪以，0. %1 自稀释身对溶液照对照为按，加正因子的校自稀身 对照释计算异法构含量体其中异，构体 、A构体 B异和异 构体C 的校 因正子别分为1 .2，2.07，1.21。52 . 424.1. 法学考方 专察属性试 验①统适用系试性验。“2取2”

.cehmSttiona色 谱 作 工站( 美 国 gAleitn 公司 ) B；2S15电 子析天分平(国德Sa toriros 公司)u。他 达拉非照对品H(LCP 纯度 10.07%4，制自；)达拉 非他异体构A 对照品(H LCP 度 纯9.482，自制%； )他拉非达异构体 对照品(HPLC B度 100.00纯，% 制 )自 ；他达非拉异体构 C照品对( HPL C度 9纯.97%6自制)；他达，非拉品(样制自)；腈(色谱 纯，美乙国Te da i公)司；水超为水，其他试纯均剂为 分析纯。2 21 方法与.结 色谱条果 色件柱谱 CH：IRLPAK-IAC柱( 250 m×4.m 6mm ， μm5 )；流相动：乙腈- 水 4(0∶ 6 )0；检测 长波 ：22 n2；柱m：温30 ℃；流：速1. mL·min 0进； 量：样02 Lμ 。.22 溶的配液制 2.2. 1照品溶对液分别精密 取异称构 A体异、构体 B 、异 构 体 对C照各 品25m g，置 10 m0 量瓶中，L 加乙 40 腈mL 解，溶用水稀定容释，匀摇；分精 密量取别 mL，1置100 m L量 中，瓶加乙腈 4 0m，L用水 稀定容，摇释，作为对匀照品储备；精密液 量取对品储照备 液1 L，置m10 mL量 瓶中加，乙腈 4mL， 水用稀释定容摇，匀，为对作照品溶液

·。0·

1

9下项对品溶照液供试、品溶液空及溶白 (剂40乙% 腈水液溶各)量适按，2“.1”下色项条谱件别进分 ，样录色记图谱结果，见 图2结。显示，果白无 干空扰 ，他达拉非及异体 A构、异构体 B 和构体 异C 峰离良好，分离度分1>.，5他拉达

非、构异体 A

、国现代应用药学 中0217年 1 月 第3 卷4第 1

C期hni J MdoA pl pParh,m2 017Ja unray ,oVl34 N.o1.

异

体 构B和异构 体 理论C数板别为 分6 73 ， 62 65，8714 ，7 676。8

行线性进归回结，各异果体及他达拉构在非各 自进样浓范度内围峰面与积线性关良系好见表，1。

2图

系统

用适性验结试图果

图 破3试验结坏果图A酸

坏；破B碱破坏；热C坏破；D光坏破1；构体 A；2异他 达拉非；3异构体 C。

空A；白 B供品试入加构异体对品；照C 供试品； 混合对D品照 ；1异体 构A2；构体异 ； B他达拉非；43异构 体C。

F

ig.2 resu lst

HPLCchro mtaorgms ofa interefrecn eexpreient

m

igF. H3LC cPrhmotogramas fo Frced doegraation exdepirenm trsuetslAac

did gradetaoni B;abs eedgraatdoin;C hae degtadatroi; nDlihtgd ergaation; 1dsomireA 2tadala;fil; 3isomreC.

Alabk; nBsmaple wth iiosmerrefe encesr;Cs mpal;e Dimedxrefe enrecs o tfdalaailf nda siomrs; 1eisomr e; A2isome Br;3 ataldfai;l 4soimr Ce

.

②强破力坏试。称取验他达拉供非试品25

m，g 置10 L 量瓶m，中乙腈溶解 定并，容 摇， 作匀为坏母破液 分别。进行破酸坏试验加 ( m4l·oL1 盐酸溶m液 1 Lm，50℃ 热加1 ，h用 4m l·oLm1氢 氧 钠化溶液和中)、破碱试坏(加 2 m验o·lmL 氧 氢钠溶化液1 m ，室L放温置 0 m3i，用n2 m o·lmL1 盐酸中和)高温、破试坏 验(0 6℃放 8置 h和)光破 [(4 50坏±0500lx 光)照度下放置 72 h强]由于，过 化氧氢会破选用坏谱色的柱定相，因此固未进行 化氧坏破将。破坏的后液用溶动流稀相释容于定10 m L 量，瓶摇，匀按2.“”1项色下条谱进样 分件析。结果图 见3试验结。显示，他果达拉在光 非坏及热破破坏件下稳条，碱破坏定条下主件生要成异 体 A，构破酸坏条下件主要生少成量的异构 体A 和异构 体 。破坏C物产主峰与，坏破产之 间物分离良好。 .42.2线性 关的系察考及正因校的子定 测分 别取2.2.1“”项异构体 A 下照品储对备，液 2.“2.” 3项下身稀自释对照储液 备.100，.，0.5，1.0，1.28 1，5 mL，.“取22..”1下项异对体 B构异构，体 对C储备液 照02.0.5，，.801.，0，12，.1. m5，分 L别置 于10 mL量瓶中，流动相 释稀定，容摇匀 ，按“.1”2项下谱条件进色分样，以析测待质物量 浓度x，(n·gLm)1横坐标为峰面，(积y为)坐纵标，

中国代应现药用学 217 年01 月第34 卷 1 期

第

表

1线 性关系校及正因 Ta子. b1 Reulst of slnearityi nad

成 异构分 A体 构异 体B他 达非 拉构体 异C 归方回 程=y0.1289x+ .08485 =y.103 1x40+64.6 7=0y1.059x+ .21414 y= .01231x+1. 097 8 r0.9897 0 .9796 0. 98 950 .97 9 3线性围范/ n·gmL1 25.~379.355 0.~637.95 62.6~39.90 05.~348.7 校0 因正 1.22子 1.70

1.25

.4.2

3

检测限定量限

和

“将2 .21 .”下对项照

品溶液

用流动逐相稀级释进样，信噪当约为比 3 ， 时得检测限；测当噪信约比为 0 1时测得，定限。量 结表明，果构异 体、异A构体B 和异构体 C检 测的分别为 限1.272，53，2.5. n2·gLm；定限分量 别 25.为，530.65，.04 g·mnL(n=6，RDS 分为别5 3.%，72.88，2%5.4)。%2 .4.4 器仪精度密验试 取“ 22.1.”项下对 品 照溶适量液，“2.按1项”色谱条下件重进样分复析 6 次。果结明表，异构 体A、异构 体 和异B体构C 的峰面 的 积SR 分别为 D1.1%51.14%，1.9，4% 表，该方法仪明精器度良密。 好24.5 重.复试性 验精密称取他拉非供试品达 量共适 6份 分别，加一定量入异构的体A， 异构 B体 ，异构体 C照品对储溶液，乙备腈解，水稀释溶定容 成每 1制 L 约含他m达拉非0 .5 2g，m含异构体 各.25 0μg的溶液 6 ，份按2.1”“下色项条谱件样进分析，结 异构体 A果、异构 体、他B达拉和非构异Chi

J nMo Adpl Pphrma 2,017 Jnaaru,yVo l.34No .

1·1·

9

体

C 峰的面积 R的SD分别为 1 44.，% 1.6%4 4.8，%9。2. 4.6加样 回率收验 精密称试他达取非拉供试 共品9 份 分，加别入定一量异构的体A、 异构 体 B 异和构 C体对 照品备储液，溶制成异含构 A体、异 构体 B和 构体异C 低、中 高浓度(、15，2205，3 7 5gnmL )的模·拟品。 样法依定， 测算回收计率 加，样收率分别为 1回0.7%5，969%.9，.85%(n9=。) 24.. 7稳性试验 取定2“..1”2项下对品照液溶 于室，温 及4 ℃放下 置，3，602，0，62，4 h 8 进测定； 样 “取22.2.” 下供试项溶品于液温及 室 4℃ 下放 0置，3，212，，3644， 8，按h“.2”项下 色谱条件进样1测定各；构异对照的体面峰积RSD

项1

色谱条进件测定，行录记色图，按照加谱校正子 因自身的释稀照法对算异计体构含量，结果见 2表。

2 表3批 样品定测果结n=()3T a.b2 D tereinatiomnre ulsts f osamlpes(=3)n

品样批号 第批1第 2批第 3 异批构体A 0. 08 0.106 1

3

31

.

讨论异构体 产生 他达拉的非 以D-氨色酸甲酯盐酸和盐椒胡为

起始醛原，料依次氯乙与酰及甲胺反氯，应最生 成他终达非拉 合成，过程图 4。见异构体 C 由于性 合成手入引，他而拉达异构体 非A和异 构体B 由起 原料始 -色D氨酸酯盐酸盐甲中的L 异构型体应反后引 入10[。]异构体成生过程图 见5。

图

Fig.44

他

达非合拉成过 程Sythetnc rioteuof ta adlafl

i

1-色氨酸D甲盐酸盐；酯胡椒2醛

；3(R6,12a)R四氢喹啉-；4他达非。 拉D1tryp-othap nmehtl yeset rhydochlrordei;2 ehloitrponi; 3(R6,1aR2)-tetarhdyoquirolinne;4t daalafli

.

图

5他拉达非构体生成过异程

1-D色酸甲酯盐氨酸； 盐2胡醛椒 ；3(6,S2a1)R-四喹啉氢 ；4异体 C构 5；L-色酸氨甲酯盐酸盐；6( 6,S21aS-四氢)啉喹；7 异构体 ； 8(BR6,1a2S四)喹啉；氢9异体 构。

AigF 5.

ynStheti coutre f otadalail ifsomre

1Ds-tyrpopthan etmhyles tr hydrechlorioe;d2 hleoirtoinp 3;(S612aR,-)etrahtyroquidnlione ;4simeor A 5L-;emtyhlt yrtopphn hadyrchloriode;6 (6S,1aS2-)ttrehadyorqinolune;i7 somir e; 8B6R,(21aS-t)erthydarquionoline ;9simeroC. ·

92·

C

in Jh ModAp lpP hram,2017 Jnaurya,V l.o3 4N.o

中国1代现用药应 学021 7 1 月第年3 4卷第 1期

.3 液相2条件确的 3定2..1波长的 择 选他对达非拉异构体、A、异构 体 和异B体 C 构进紫外行光扫谱，描 果结异体 A构 异、体 B构和 异构体C ，他 拉达非最大吸收的长波 为均 212~223nm，因此 选择 222n m为测检长。 3.2.波 流动2相比的例选择 笔者考察不同了流动相 比例，下他拉非及达异构体的分各效果。结离果 表，随明着有机相由60 %低降至4 %0，达他 拉非 及其 构异 体的 保 留 时间 由5~0 m1i n增加 到 1~25 7imn，各物间的最小分离质由度1. 4 增加到1 .521但有机相，例继比降低至续35% 保，留时间移至 30 in m以后 峰，增大， 宽且最小离度分降 为118，.因此最终 确流动相比定为乙腈-水例40(6∶0。 CH)RALIAPKI-C 性柱的硅胶表手面合键了纤维 -3素，-5二苯基氨氯基酸甲酯其主，的要性手 作点是用基羰或基甲酸酯氨具，有极性团基的消 旋外化物可以与合氨甲酸基酯部位通过氢键相作 互用达到而手性别识 1[]。他达拉1非及各异构体子 中一个分性手原与羰基子相连，该羰基可固与相定 上氨基的之间形氢键成，可与也固定相的上羰基发生 偶-极偶极作，用时同与另，个一性手子相 连原的环苯与，固定的相苯环之间在的存 -ππ作 用， 这分些间作子力用是固相定他与拉非及达其映 对构体异及非映对异构体的主要别识机制另外， 。定相固苯基上部包含吸分电的子，氯达他非及拉各 构异体分中子有供子电的基，也会甲提手高 识别能力性同。时流，动中相乙的腈的中氮有含 孤对电子能与他达，非及异拉体构子间分形成氢键， 低流动相中的降有机比相时例，得他达使拉非及各 异构体与流相动间的氢作用键减力弱与固定 ，之相的间氢键用力增强，因此作物各在色谱柱 上质的留保增，分离强果得到改效。 3.善.2 流3动 相H 的p择选 磷以酸氢钾二缓溶 冲液节流调动 pH，考察了相动相 p流H对他 拉非 及其达异体构离行为的分响影由。于选

用的谱色柱 p的 H使范用为 2围~， 因7主要此察 p考H为 2， 3， ，5，467， 件条的下液相效。果结表果明当流，动相 pH由 2加增 7， 到各物质间的分离之度增大 峰宽减，小，但是分度及峰宽变离化幅度很小都， 调 节Hp 分对的影响很离小。 他达非拉构结杂中氮原子显环弱碱性， 其 Kap 1为[82]。1 pH在 2~7 范围的，内调节流动的相 p H并没值明有改变显子的分解离状，态 由于pH 改的 变要作主于用达他拉非及各异构结体构氮，对

中中国代应现药学 用2071年 1 月第 34 第 卷 期1

于

响手影分离的羰基性苯和环的响影不大因此， pH 改变对分的效离基本没有果响。影4 论结 本验实立了他建达非拉映异构体和非对映对异 构体的量分析方法定。达拉他及异构体非A ，异构体 B，构体 异 峰分离C好良，别分在25 3~.793.，505.63~9.5，50.7~473.0 n8·mgL 1线 内性关 良系 (好=0.r99 7~3.9908 7 ，) 测检 限 分别 12为. 7， 25. 3， 52.2 g·mnL1 ， 加样 收回 率分 别 10为.57，% 9.69， 9%.85%， 样进精密及重度复性 RS ≤2D%。 批3品样异构体中A 最含量高为 .001%， 异构体8B 及 构体 C 异未超过均测检 限小于(达他拉非 含量 0.0的1%0)。验结果表实明本，验实开 的 发HPLC 法简方单、准、确便，能方够时测定 同达拉非他 的 种3构体，异可用于制他达控非拉 的映对构体及非异映异构体对。

RFEERECESN

UDNA XG .T dalafali of erercitled yfusction: nA ovnrviee [wJ] Na.ltJ nAdro(中华男l科学医志),杂 213,0 1(4)9 :830-38. 3[2 ]AIB WJ. Taaldfal iforerect le disfyunctino:ex ecllne tsaetyf an dolternca [Je.] atl NJAndr lo( 中华男学杂科 ), 志209,015( ):192-9 5.[ ] 3ZHNG EL, ILUQ Q, J NGI CZ Phosph.dioetseasret yep in5ibhitrosi n thet eatrmnte o pulfonarym rateiar lhyerpentions[J] W.oldr Cln Diugr世界临(床物), 药012,43 (5):632 1-325 [4. T]AIS MB,TU RRNEINT ME , SWhERIADN BC, t ael Di.fferetinaleff cts ofe phopsodihetse ares5-i hinbtirso no yhoxpi pulcmoary vnsoacnotsrcti oin ad nuplmoanyr raerytyc tkioen expresi ons[J ].A n nhorTca Sug, 20r06 8,(1)1 :72-2287 [5] .MAENSHCI ,E ECLLIAI, VEARS A, eA atl.Ta daalfli eruced siscevrla aidpos etssuie accumultiona yb ropmoint pgraeidpocytsediffe rneitaton towaids ram etaoblcaily leahthyl hpnoetpye :tsuidesi n rbbitsa[ ]. JMol ClelEnd coirno,l 216042(4: )0-75. 06][DA GANU A, RONGID N,P UARUT C, eLtal .Tehdis ovcrye of atalafdl:ia no elvand hi hgly elscetiev DEP 5nhibiitro 2: .,2 3 6,, 7, 1, 221-ahexhyarodypazrio [1n' ,2':1 ,]6p riyd o3,[4 -b]i ndleo-, 4-1doineana logues[J . J ]Md Cheme ,2003 ,64(12:) 433-54542 .[7 QI]UY , ZHJUOY . DHteremnatioi ofn legal idaddeunkno wnsi dlenailfsubs atcnes inh eatl hcae rroductspby PLC-UTOF-MQS J].[ ChinJ Me d pAl pharP(中m现代应国用药),学2 150, 238(: 10)0010-04 [8.]E P8.0[ ]S. 359-33316. [] U9S P3 [S].8543 -34375. [10]XI NOGY J .es

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earc hrpgreoss on ystnehictp orcses f toadalafilf r otreatnige retcle idysfuction n[]. JhiCnPh ra(中m 药业)国, 210, 10915(: 1-3) .1[] 1AMS J ,J IA X ,SUNH , Bt el. Enanaitosearptiao of 2,2n'd-iyhdroy-x11,'b-inphthya olnce lullso chiral e[J.]J Zhe nghouz niU veMd Sic( 州郑学学大报 :学版医), 2013 , 4(81:)12 0-123.[ 21 F]SSOL E E. TTreatment o erefcitel ysdunfciontan odthr eniidctianso :US US,201400 15770 1[A].P 2140 收稿.日：2期0160--23 4hiC nJ oM dpAplPha rm ,217 0anJaruy ,oV.l4 No.3

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