质粒转化农杆菌 感受态制备
04-11
感受态制备
1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101
2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或 Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：
1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；
3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；
4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；
5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；
6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；
制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：
1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；
2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；
3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；
4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）