磁珠分离技术

磁珠分离技术

摘要:磁珠分离技术是一种分子生物学分离技术, 它利用其表面修饰的磁性颗粒

对生物分子或细胞的亲和结合而进行分离, 能对待分离或待检测的靶标进行高

效富集, 是一种方便、快速、回收率高、选择性强的方法。磁珠分离技术在生物

学方面的应用始于20世纪70年代后期, 目前已经在分子生物学、细胞学、免疫

学、微生物学、生物化学等领域取得一些令人瞩目的研究成果。

基本概念

磁珠 磁珠是一种通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有

一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的载体微球。载体微球的核

心为金属小颗粒, 常为铁的氧化物或铁的硫化物, 核心外包裹一层高分子材料,

最外层是功能基团, 载体微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－

COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧

基、—CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等

不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。 由于载体

微球表现的物理性质不同, 可结合不同的免疫配基, 如抗体、抗原、DNA、RNA 等。

应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点: 粒径比较小, 比表面积

较大, 具有较大的吸附容量; 物理和化学性能稳定, 具有较高的机械强度, 使用

寿命长; 具有可活化的反应基团, 以用于亲和配基的固定化; 粒径均一, 能形成

单分散体系; 悬浮性好, 便于反应的有效进行。载体微球有纳米级、微粒级的, 纳

米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点: 尺寸小, 扩散速度快,

悬浮稳定性好; 比表面积大, 偶联容量大; 超顺磁性, 能快速实现磁性粒子的分

散与回收。

磁珠的制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋

法及原子转移自由基聚合法等。

免疫磁珠 免疫磁珠(Immunomagnetic bead, IMB) 简称磁珠,免疫磁珠由载体微球和免疫配基结合而成。免疫磁珠的大小和形状的均一性, 可使靶细胞迅速和有效地结合到磁珠上; 它的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合; 超顺磁性可使磁珠置于磁场时, 显示其磁性, 从磁场移出时, 磁性消除, 磁珠分散; 保护性壳可防止金属颗粒漏出。

将磁珠按磁珠功能基结合的蛋白质不同分为: 包被一抗的磁珠、包被二抗的磁珠、未包被的磁珠和包被抗生物素的磁珠。并针对不同抗原制出包被相应抗体的试剂盒,方便了使用。

免疫磁珠的主要特点有: 分离速度快、效率高、可重复性好; 操作简单、不需要昂贵的仪器设备;不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能 免疫磁珠标记方法 1 直接磁珠和直接标记法：通过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合，然后再与相应细胞结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠复合物，在外磁场下直接分离目的细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高，灵敏度低，需制备相应的偶联抗体磁珠。2 间接磁珠和间接标记法：使用anti-lg等与磁珠偶联，通过Anti-lg再使磁珠与二抗体偶联，分离细胞时，先使细胞与一抗特异性结合，然后在与一抗标记磁珠结合，形成细胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠复合体，在外磁场下分离目的细胞的方法。该法增加了细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。该法一般用于①没有直标磁珠抗体②需用几种抗体去除多种细胞③目的细胞上特异性抗原分子表达水平低。

免疫磁珠分选方法 阳性分选：运用特异性抗体偶联磁珠直接从细胞混合物中分离目的细胞的分选方法称为positive selection. 阳性分选中磁珠标记的细胞即为目的细胞。该法简单、快速、细胞得率和纯度较高。如采用anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。阴性分选：用抗体偶联磁珠去除无关细胞，使目的细胞得以纯化和分离的分选方法称为negative selection.阴性分选中磁珠标记的细胞为非目的细胞。如分离CD4+T细胞时，由于没有专用的CD4+T细胞分选磁珠，可通过anti-CD8、 anti-B220、 anti-CD49b、 anti-CD11b、 anti-Ter119标记磁珠去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞等，最终而获得较纯的CD4+T细胞。因此阴性分选法适用于：①从细胞混合物中去除某种类型细胞。如肿瘤细胞。②缺乏针对目的细胞筛选的特异性抗体磁珠时。③抗体和目的细胞结合可能

诱导细胞活化，影响后续细胞功能分析时。复合分选：将阴性分选和阳性分选相结合的分选方法。当目的细胞含量特别低，无法直接进行阳性分选时，可采用阴性分选发先出去其他杂细胞，当目的细胞富集到一定程度时在采用阳性分选发筛选目的细胞。

基本原理

特异性及非特异性的磁珠分离技术

特异性磁珠分离技术 免疫磁珠分离技术是一种特异性磁分离技术。免疫磁珠既可结合活性蛋白质( 抗体) , 又可被磁铁所吸引, 经过一定处理后, 可将抗体结合在磁珠上, 使之成为抗体的载体, 磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后, 则形成抗原一抗体一磁珠免疫复合物, 这种复合物在磁力作用下, 发生力学移动, 使复合物与其它物质分离,而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠作用方式有直接法和间接法。直接法是先用抗体包被磁珠, 使抗体与磁珠结合( 物理吸附或化学结合) , 再加人抗原物质, 二者结合形成复合物,在磁力的作用下, 与其它物质分离。间接法是先用羊抗鼠IgG ( 第二抗体) 包被磁珠, 使磁珠作为第二抗体的载体, 当抗原与第一抗体结合后, 加入带有第二抗体的磁珠, 磁珠上第二抗体便与第一抗体结合, 形成磁珠一第二抗体~ 第一抗体一抗原复合物, 在磁力的作用下, 与其它物质分离。

这里值得提及的是免疫磁珠的功能基团主要与蛋白结合, 但是借助亲和素一生物素系统,还能使免疫磁珠与非蛋白质结合, 如各种DNA、RNA 分子等, 从而使免疫磁珠发挥更大作用。

非特异性磁珠分离技术

裸磁珠分离技术: 裸磁珠是指尚未包被抗体的磁性载体微球。有研究表明具有超顺磁性的裸磁珠能非特异性的吸附细菌 , 把裸磁珠加入到待检样品中, 裸磁珠可以和样品中的细菌发生非特异性的吸附, 裸磁珠细菌结合物在外加磁场的作用下向磁极方向聚集后, 弃去检样混合液, 反复洗涤,可使致病菌与样品得到分离, 目标菌得到浓缩。当食源性疾病发生时, 往往很难确定食源性致病菌的种类, 用某几种免疫磁珠吸附分离可能会导致漏检, 裸磁珠的非特异性吸附可克服此不足。有关专家对裸磁珠用于样品中多种食源性致病菌的吸附分离和浓缩进行了

一定研究。

磁泳分离技术: 刘新星等根据某些细菌具有一定趋磁性的特点提出了一种新的微生物分离方法- 磁泳。该方法采用电泳槽、毛细管、永磁体组成磁泳槽, 在远磁槽中加入菌液, 在近磁槽中加入培养基, 体内含有磁性颗粒的细菌在细长的毛细管中借助连续的磁场梯度提供的磁力进行泳动, 而体内没有磁性颗粒的细菌则留在了远磁槽中, 这样具有不同趋磁特性的细菌得到分离。在液体磁泳的基础上进行改进,提出了固体平板磁泳分离细菌的新方法, 通过磁泳分离, 在固体平板上可以得到待分离细菌的单一菌落, 磁泳技术的进一步完善和改进为传统的菌种分离提供了新的途径。

应用范围

特异性的免疫磁珠分离技术目前比较成熟, 在诸多领域得到了广泛应用; 非特异性的分离技术研究有待深入, 没有特异性的免疫磁珠分离技术应用广泛。 免疫磁珠分离技术的应用范围

它是近年来国内外研究比较热门的一种新的免疫学技术, 它以免疫学为基础, 渗透到病理、生理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域, 其应用日趋广泛, 尤其在免疫学检测、细胞分离及蛋白质纯化等方面取得巨大的进展。

1. 免疫检测

在免疫检测中, 免疫磁珠作为抗体的固相载体, 磁珠上的抗体与特异性抗原结合, 形成抗原抗体复合物, 在磁力作用下, 使特异性抗原与其它物质分离, 克服了放免和普通酶联免疫测定方法的缺点, 无放射性损害。这种磁性分离具有灵敏度高, 检测速度快(l , 一2 小时) ,特异性高, 重复性好等优点。文献报道利用免疫磁珠可检测出诱导活性T 细胞产生极性现象的膜表面分子, 这种极性现象可通过观察到一个磁珠结合处, 许多T 细胞形成网状微管状结构来判定。其方法是将7 X 10 咯个细胞吸人特殊处理的有机玻璃制成的直径x6 n m, 深4m m的孔内, 培养30 分钟, 待细胞附壁后, 加人包被抗体的磁珠, 磁珠与细胞比例红1 , 混匀, 培养45分钟后置于磁场中,弃去上清, 荧光染色,在荧光显微镜下观察吸附在孔壁底部T 细胞变化, 结果发现人T 细胞系H P B一A L L 中C D 3类T 细胞具有这种极性现象, 而C D Z、C D 6 、仁公旦类T 细胞则无极性出现, 由此可检测细胞攀

表面的特异分子结构。实验结果显示, 包被抗极性诱导分子C D 3 膜表面分子抗体的磁珠产生的极性现象, 是包被抗其他分子抗体磁珠随机产生极性现象的3。倍, 其结果具有统计学意义。这种技术, 不但可通过产生极性现象来检测表面分子, 亦可通过磁珠包被任何确定的表面分子或结合分子来检测是否可产生极性现象, 从而来判断细胞类型。总之, 用免疫磁珠可检测出各种激素、神经递质、细胞因子、肿瘤相关抗原等。

2. 细胞分离

细胞分离是免疫磁珠目前应用最主要的一个方面。传统细胞分离技术有密度离心、羊红细胞重新形成、流式细胞等, 这些方法或者比较费时, 或者十分昂贵, 而用免疫磁珠进行细胞分离只需要抗体和一个磁铁, 具有简单、便捷和可靠等优点。分离细胞有两种方式: 直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法, 称为阳性分离( P o s it iv e I s o lo t ; o n )。用免疫磁珠去除无关细胞, 使靶细胞得以纯化的方法, 称为阴性分离( N e g a t iv e Is o la t io n )。阳性分离涉及到磁珠与细胞的解离问题, 一种解离方法, 是简单的在摄氏3 7 毛过夜使之分离; 此外, D y al l 公司D E T A cH a B E A D 分离系统, 直接解离抗原一抗体, 因此所得到的细胞无抗体残留, 而且没有改变细胞抗原的表达, 细胞的活性或功能也不受影响。已有许多文献报道: 免疫磁珠技术可用来分离人类各种细胞, 如T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、内皮细胞. 造血祖细胞、单核/ 吞噬细胞及胰岛细胞及多种肿瘤细胞。近来,S h Pa i c)r等利用免疫磁珠技术, 从19 例W 期乳腺癌患者外周血中分离到C :)[ 科+ 的单核细胞P( BM C ) ,离体做C D 34 十细胞增殖实验, 最后将增殖的细抱重新输人病人的体内, 以克服多次大剂量化疗所带来的副作用。具体方法是, 首先给未接受化疗的晚期乳腺癌病人注射环磷酸胺和粒细胞集落刺激因子, 取外周血, 用白细胞提取法收集单核细胞, 将收集到的细胞与包被C D 34 十抗体的磁珠混合, 磁珠与细胞比例为16 : 1,4 C 下培养拍分钟, 磁珠吸引, 弃上清后重新悬浮于溶液中, 在5 纬C O : 培养箱内37.0 ℃ 过夜。第二天移去分离的磁珠, 得到C D 34一卜细胞。此方法获得的C l ) 3 4十细胞纯度在56 % ~ 92 %。这样获得的C D 34 十细胞再培养结果, 第7 天,细胞增殖15 倍, 第14 天增殖40 倍, 第21 天增殖4 6 倍, 第28 天增殖21 倍。很多研究表明,细胞分离不仅有利于肿瘤细胞的净化, 而且为临床肿瘤治疗提供了新的途径, 使免疫磁珠技术广泛应用于: ① 检测出体

液中少量肿瘤细胞,提高肿瘤早期的诊断率, ② 快速、高效分离T、B 细胞, 用于器官移植中的H L A 组织分型, ③骨髓移植物的预处理, 提高移植成功率( 自体移植时清除骨髓移植物中残留的肿瘤细胞, 异体移植时清除骨髓移植物中的细胞毒性T 细胞) , ④ 为各种医疗与科研目的分离或清除特定的细胞成分。

3. 生物大分子纯化

免疫磁珠可以看作是亲合层析技术中的微型配基载体, 在基质上固相化抗体或抗原后, 造成特异性吸附, 再进行磁性亲合抽提, 不需离心和过滤, 用于分离和纯化相应的生物大分子,这为受体分子提纯和其它难以提纯的蛋白质纯化提供了希望。此外, 以免疫磁珠作为固相载体, 还可分离纯化D N A 和R N A , D N A 结合蛋白及m R N A 等。用D y n a b e a d s M~ 4 5 0 C D 1 4 和D y n a b e a d s 砚19 0 ( d T ) : 。可从单核细胞中提取m R N A。具体方法是, 用D y n a b e a d s M一4 5 。C D 14从外周血中分离纯的单核细胞, 得到纯的单核细胞, 再将D y n a b e a d s 0 119 0 ( d T ) 2 5加到细胞液中杂交, 可分离到纯的m R N A, 实验可在60 分钟内完成。

4. 分子生物学的应用

由于免疫磁珠借助亲和素一生物素系统可与非蛋白质结合( 如各种D N A、R N A 大分子) 所以近年来免疫磁珠在分子生物学应用越来越广泛。随着P C R、R T 一P C R 等分子生物学技术突飞猛进, 通过对P C R 产物进行测序分析, 虽可了解基因组的结构特点、D N A 突变和基因多态性等, 但方法比较复杂。文献报道, 用磁珠固相分离单链法, 测定了低密度脂蛋白( L D L ) 受体基因外显子H 和内含子n 的部分序列, 可直接快速对P C R 双链产物进行分离或对其单链进行测序。方法是将P C R 双链产物与生物素化磁珠混合, 悬浮30 分钟后, 置于磁场中沉淀,去上清, 洗涤后进行碱性变性, 再次磁场沉淀,此时沉淀的磁珠结合了含有生物素的P C R 单核D N A, 而不含生物素的P C R 另一单链DN A则存在于上清中。

5.在核酸与基因工程上的应用

免疫磁球可以看作是亲合层析技术中的微型配基裁体，借助亲合素-生物素（Biotin-Avidin）系统免疫磁球可与非蛋白质结合，生物素和亲合素间有着高度的亲和力，两者的结合迅速、专一、稳定，在分子生物学、医学、免疫组织化学等领域中的应用也越来越广泛，与生物磁珠技术结合后，更是产生了诱人的发展

前景，并广泛地应用于分离纯化RNA、mRNA、核酸片段等及相关研究。河南惠尔纳米科技有限公司很早就在从事该方面的研究，并且已经研发出多款磁珠法核酸提取试剂盒，性能相当稳定。

6.用于分型

免疫磁珠法可被应用于临床器官移植供受者的快速选配。在高梯度磁场下,用免疫磁珠法分离静脉或腹腔血中T、B淋巴细胞，并利用分离的淋巴细胞进行HLA-ⅠⅡ类抗原分型。如采用磁珠技术和单抗试剂建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ类抗原一类分型的新方法，还可应用免疫磁珠分离技术进行肾移植供受体的HLA分型、探讨血液病患者反复血小板输注的治疗效果与HLA之间的相关性。

7.用作靶向释药系统的载体

免疫磁性微球作为靶向释药系统的载体可使免疫磁性微球上的抗癌药物更易与癌细胞接触，服用这种制剂后，在体外适当部位用一适宜强度的磁铁，将磁性微球引导到体内特定靶区，提高了杀伤癌细胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了针对不同癌细胞的免疫磁性微球，作为靶向释药系统的载体并在实验中证实这种释药载体具有良好的功效。

免疫磁珠分离技术的应用实例

免疫磁珠分离技术在食品安全检测中的应用

免疫磁珠对病毒具有特异选择性，因此能用于食品有害微生物的检测。免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性分离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物的检测。

大肠杆菌O157的检测

传统分离E.coli O157∶H7所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。

采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中分离富集E.coli O157∶H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。

现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准（GB/T 4789.36-2008）和出入境检验检疫行业标准(SN/T 1059.5-2006)。已有市售的专用

免疫磁珠销售。

具体操作

1增菌

2免疫磁珠捕获与分离

1.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E. coli O157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支Eppendo - rff管的盖子，每管加人20 μL E. coli 0157免疫磁珠悬液。

2.取mEC+n肉汤增菌培养物1 mL，加人到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡10 s。每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。

3.结合: 在18℃~30℃环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在Dynal MXl样品混合器上转动或用手轻微转10 min，使E. coli O157与免疫磁珠充分接触。

4.捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3 min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。

5.吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复4步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。

6.洗涤:洗涤免疫磁珠混合物，重复上述步骤 4~ 6 和4 ~ 5 。

7.免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在100 μL PBS-Tween 20洗液中。

8.涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50 μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板一侧，再用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36℃士1 0℃培养18 ---24 h 。 菌落识别

在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌落为红色;在改CHROMagar O157弧菌显

色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。 初步生化试验:

在CT-SMAC和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板上挑取5个~10个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于36℃士1℃培养18 h~24 h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36℃士1℃培养18 h~24 h，并进行鉴定。

Fratamico等将兔抗E.coli O157∶H7多克隆抗体连接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，从食物增菌培养液中分离O157∶H7菌株，再将带菌的磁珠接种到培养基上，加入荧光素标记的O157∶H7抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为10cfu/mL增菌培养液。

Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂质体（IMB/IL）荧光试验方法，可在8h内快速检测出多种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至1cfu/mL的E. coli O157∶H7，而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出E. coli O157∶H7感染样本。

结论

免疫磁珠分离技术的优点是:分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单，不需昂贵仪器设备,不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等,从而在微生物检测方面具有很大的优势。缺点：免疫磁珠敏感性不高，易于其他杂菌交叉反应，价格昂贵，应用受到一定限制。

免疫磁珠分离技术的发展方向：高敏感性磁珠的制造技术，降低磁珠生产成本，免疫磁珠与其它检测手段联用技术，免疫磁珠技术应用技术， 总的来说，免疫磁珠分离技术未来将在生物医学、食品、农业科研、新药开发等领域具有更加广泛的发展前景。

参考文献

1. 免疫磁珠技术一一种新的免疫学技术(北京医科大学人民医院妇科仲痴中心范蓉编译钱和年审阅)

2. 段旭昌--免疫磁珠分离技术(IMB)及在食品生产中的应用

3. 磁分离技术及其在食源性致病菌监测中的应用-熊国权1, 周红雨2

4. 在环境病原微生物检测中的应用-杨万,何苗