层析柱的一些总结

多数微生物碱性蛋白酶不耐热，碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用

碱性蛋白酶是加酶洗涤剂的主要添加剂之一，在丝绸、制革工业中也有广泛用途

热稳定性 将酶液分别置于不同的温度条件下（30℃，40℃，50℃，60℃，70℃）保温 10min 后，立即在 0℃冰浴中冷却，然后在 40℃下测碱性蛋白酶活力，以剩余的酶活性作为评价酶的热稳定性的指标。测量三个重复求平均值，将最高的酶活力定义为 100%，分别计算不同温度条件下蛋白酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。

以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以

缓冲液的PH＝pI值＋1，上阴离子柱，＝pI值－1，上阳离子柱，一般缓冲液ph范围在6.5～8.5之间，与PI值相差1个PH是比较理想的。

如果不清楚PI值，可以将蛋白溶到PH梯度的缓冲液里，然后分别试阳离子和阴离子填料（50ul左右得体积就够了），看那个PH下挂得好。

强离子交换剂: 在宽pH范围内载量稳定，所以他的优点是不同pH下载量恒定，可控性好，平衡过程快速、简单。

弱离子交换介质的缺点：适用的pH范围比较小，随着pH不同载量发生变化。但是大部分蛋白等电点在

5.5 ~ 7.5 。因此强/弱离子交换介质都可以使用

弱离子交换介质（DEAE、ANX、CM)优点在于：和强离子交换介质的选择性不同，因此我们一般先使用强离子交换，如果优化条件还是达不到理想的分离效果，可以尝试弱离子交换，用选择性不同的介质尝试一下。

因此弱离子交换与强离子交换由于选择性不同，可以说是对不同蛋白的结合力有差异。S

技术规格

离子交换剂类型

Q Sepharose FF 季氨基，强阴离子

DEAE Sepharose FF 二乙基氨基乙基，弱阴离子

ANX Sepharose 4FF 二乙基氨基丙基，弱阴离子

SP Sepharose FF 磺丙基，强阳离子

CM Sepharose FF 羟甲基，弱阳离子

离子容量

Q Sepharose FF 0.18-0.25mmol（Cl-）/ml

DEAE Sepharose FF 0.11-0.16mmol（Cl-）/ml

ANX Sepharose 4 FF 0.13-0.18mmol（Cl-）/ml

SP Sepharose FF 0.18-0.25mmol（H+）/ml

CM Sepharose FF 0.09-0.13mmol（H+）/ml

动态载量

Q Sepharose FF 120mg HSA/ml 填料

DEAE Sepharose FF 110mg HSA/ml 填料

ANX Sepharose 4 FF 5mg 甲状腺球蛋白/ml 填料

SP Sepharose FF 70mg RNAase/ml 填料

CM Sepharose FF 50mg RNAase/ml 填料

压力/流速

Q Sepharose FF 400-700cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cm

DEAE Sepharose FF 300-600cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cm

ANX Sepharose 4 FF 至少200cm/h，100kpa，XK50/60层析柱，柱床高25cm

SP Sepharose FF 400-700cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cm

CM Sepharose FF 300-600cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cm

平均颗粒大小 90um（45-165um）

基质

Sepharose FF 高度交联琼脂糖，6%

Sepharose 4 FF 高度交联琼脂糖，4%

PH稳定性

Q Sepharose FF 1-14（短期），2-12（长期）

DEAE Sepharose FF 1-14（短期），2-13（长期）

ANX Sepharose 4 FF 2-14（短期），3-13（长期）

SP Sepharose FF 3-14（短期），4-13（长期）

CM Sepharose FF 2-14（短期），4-13（长期）

化学稳定性

在所有常用的水溶液缓冲液中稳定：8M尿素、6M盐酸胍、70%乙醇、1M NaOH和1M醋酸 20%乙醇（Q , DEAE,ANX,CM ）,含0.2M醋酸钠的20%乙醇（SP）

保存

保存温度 4℃-30℃

l 1M NaOH和醋酸仅在清洗时使用

Phenyl-Sepharose HP

产品名称：苯基-琼脂糖凝胶 6FF

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 45-165µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，快流速，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：苯基-琼脂糖凝胶 H.P.

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析填料

粒 径： 24-44µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，高分辨率，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：苯基-琼脂糖凝胶 CL-4B

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析填料

粒 径： 45-165µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等。

产品名称：丁基-琼脂糖凝胶 4FF

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 45-165µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，快流速，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：丁基-琼脂糖凝胶 H.P.

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 24-44µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，高分辨率，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：丁基-琼脂糖凝胶 4B

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 45-165µm

工作PH值：4-8

应 用：疏水层析介质，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：辛基-琼脂糖凝胶 4FF

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 45-165µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，快流速，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：辛基-琼脂糖凝胶 H.P.

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 24-44µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，高分辨率，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

产品名称：辛基-琼脂糖凝胶 CL-4B

性 状：白色微球

凝胶类型：疏水层析介质

粒 径： 45-165µm

工作PH值：3-13

应 用：疏水层析介质，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等

HPLC内容：

1、反相柱子：一般适用范围比较大。分离极性比较小的物质。极性强的物质先出柱。

ODS就是C18柱子。

RP-8和RP-18分别是C18柱子和C8柱子。

C18柱子和C8柱子是柱子的碳链的长度不一样的。

碳链增长了,也增加了键合相的非极性作用的面积,对保留值和选择性都有影响,随烷基碳链的增长对溶质分离的选择性也增强了.但是对单一或简单组分确实看不出太大区别。

2、正相柱子：一般分离光学异构体和反相柱子不能分离的极性比较大的物质。

APS为NH2柱子

另外diol 代表的是球形硅胶邻二羟基丙基醇基柱，正相柱，极性强的物质后出。

硅胶柱子的特点是可分离异构体，柱子的载样量大，用于制备分离，不污染收集的流分了，缺点是分析应用不方便，如流动相的含水量应该严格控制，再现性较差，需较长的平衡时间，不适用于梯度洗脱。 碱性化合物在氨基和二醇柱上的保留强，而偶极化合物在腈基柱子上的保留强。

建议您看看色谱分析等专业书籍有帮助的。

ODS-A

ODS-A液相色谱柱是国际上是销售最好的一种传统色谱柱，同时也是HPLC中应用最广泛的应用。YMC ODS-A液相色谱采用高度封端的表面结构和具有适当的疏水性，广泛地应用于多种化合物的分离。在严格质量控制体系下，对50个以上的参数进行严格控制， 保证了稳定的质量。其通常作为液相色谱标准柱。 ODS-AM

ODS-AM液相色谱柱是一种高碳含量的C18柱，具有和ODS-A液相色谱柱相似的选择性。二者的主要区别是ODS-AM液相色谱柱采用的是专利的封端技术，采用十分严格的生产技术规范，可提供优良的峰对称性和更高分离效果的重现性，从而改善较难分离组分的峰形。

ODS-AQ

ODS-AQ液相色谱填料具有中等强度的疏水性和氢键键合相色谱填料，由于其具有相对高的疏水性，其与ODS-A相比有不同的保留行为，其主要用于碳水化合物的分离，如寡聚多糖类、葡萄糖苷类、药物和天然化合物的分离。

ODS-AL

ODS-AL液相色谱柱不仅具有疏水基团的相互作用，而且还具备由硅醇基产生的第二级相互作用，这使其与传统的ODS不同的选择性。当离子间相互作用被优 化后，特别推荐用于流动相中含有缓冲液的色谱分离，可以获得高重现性的色谱图。YMC-Pack ODS-AL液相色谱柱采用的是没有封端的高碳含量单层C18相，其只能在残存的硅醇基活性有利于色谱分离时使用，由于容易发生拖尾峰，不推荐在分析胺类 或含碱性基团的化合物中使用。

ODS H80, M80, L80

ODS液相色谱填料是一种以硅胶为载体的三种配基覆盖率不同的 ODS填料，不同配基覆盖率将影响馏出物中疏水组分的保留行为，馏出物的官能基团或三级结构将决定分离行为的结果。J'sphere ODS液相色谱

填料几乎不需要考虑疏水性和氢键键合相之间的相互作用，如离子或相互作用，其多用于分离条件的测定。

色谱柱考虑的问题首 先是填料的问题，大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶填料，基于多孔聚合物担体与键和的有机表层（如C18＆C8），应用范围较广，颗粒的大小（粒 度）在HPLC中极为重要，约5um的微粒直径兼顾了分析柱的柱效，反压和寿命。更小的多孔微粒对快速分离很有用。小至1.5um的薄壳微粒对极快速地分 离蛋白质等大分子较有用。较窄地粒度分布能保证填充床地稳定、高效和压力降最小。总的来说，3或5um全多孔微球填充HPLC色谱柱，能满足大多数分离地 需要。

色谱柱地性能指标主要考虑：理论塔板数，峰不对称因子（AS），两种不同溶质地选择性，色谱柱地反压，保留值地重现性，键和相浓度，色谱柱地稳定性。

有几点看法:

1)本人认为,C18是连接了18烷基碳链的反相固定相的总称.ODS 是以硅胶为基质键合的C18填料,而C18还包括其他基质的填料,比如高聚物小球为基质,氧化铝为基质,氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相,这些可以称为"C18",但是不是ODS.

2)RP- 18也是C18中的一种,不同的公司对C18填料有不同的商业名称,本质应该都是一样的.Merck公司的填料喜欢叫RP-18. 比如Merck 的LiChrospher RP-18, Superspher RP-18,Purospher RP-18. 因此,我认为说"RP-18"是改进型的不妥当.Merck的改进表现在前边的名字上,比如LiCHrospher, Superspher, Purospher表现的是不同的性能.

3) "普通ODS分析酸性、中性或弱碱性化合物时均可以获得较佳的峰不对称度。但当分析药物化合物中的强极性含氮的碱性样品时，样品峰形就极差，拖尾严重，定 量分析精度下降",这句话我认为值得商榷.普通的ODS,在分离中性化合物,极弱性的酸或硷化合物的时候可以得到较好的峰形,对于弱至中等极性的酸碱化合 物,多数情况下会出现不同程度的拖尾.对于强极性化合物,不单是药物,其他化合物一样,都会出现严重的拖尾现象

再次修改，除掉了不太相关的BDS，应该说论述比较全面了。

C18(C-18)、RP18(RP-18)、ODS有什么区别？

答：C18(C-18)、ODS、RP18(RP-18)的写法一般人从表面上理解没多大的区别，三者之间常常混用，但在具体的不同场合，从严格意义上讲，还是有一定的区别。

一般认为C18是连接了18烷基碳链的反相固定相的总称，除了硅胶基质外，还可以包括其他基质的填料，比如高聚物小球为基质，氧化铝为基质，氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相。

而ODS 是以硅胶为基质键合的C18填料。因为大部分的C18柱是硅胶基质，因此，在很多场合内二者混为一体。

ODS其后所标的1、2、3、4、5有的是指含碳的不同，有的是不同代的替换产品，如Spherisorb的ODS-1是指未经封尾处理的,含碳量为5.75%，ODS-2是经封尾处理的，含碳量为11.5%。不同厂家的ODS柱性能差异很大。

RP 在不同厂家中使用的含义也不太一致，在waters的色谱柱中，RP18（8）是指经过改进的新型C18

（8）柱，其不同在于在经典直链配体之间内嵌极性 基团，其选择性同C18（8）有了很大的差异，特别是对含酚基官能团的化合物。Agilent的Bonus－RP柱中RP的含义同Waters。但是在 Merck公司的色谱柱中，RP-18同C18意义相同,包括硅胶基质、氧化铝基质、及一体化的Chromolith柱。

因此，光从C18（C-18)、RP18（RP-18)、ODS很难区别不同厂家色谱柱之间结构上的差异，最好从有关厂家的资料中寻找。