脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定

——水分胁迫下植物的渗透调节

【实验目的】

1.了解植物对环境胁迫的抗性生理作用，及植物对胁迫的影响机制； 2.了解脯氨酸对植物水分胁迫下的抗性生理。

【实验原理】

在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物，产物在520nm波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

【材料、仪器及试剂】

1.实验材料：小麦幼苗：对照；100mM、200mM NaCl处理48h；5%、15% PEG-6000处理48h

2.仪器：天平，烧杯 ，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅

3.主要试剂：3%磺基水杨酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿弃入下水道，请回收）、 2.5% 酸性茚三酮溶液（60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、脯氨酸标准母液：精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入500 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中脯氨酸浓度50 μg /ml。

【实验步骤】 （一）、样品的测定

1.脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2g（每种处理至少做三个平行），用3%磺基水杨酸研磨提取，分别转移至试管中，然后向各试管分别加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液用3%磺基水杨酸定容至5mL，即为脯氨酸的提取液（预先湿润滤纸，尽量全部收集Pro提取液）。

2.吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入 2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，封口以防过分蒸发，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。

3.冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置2h。

4.用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值（注意甲苯有毒，尽量防止挥发；OD520大小为0.2-0.8之间为佳，若值太高，应适当用甲苯稀释）。 （二）、标准曲线的绘制

1.在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

2.系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及 3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

3.取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

4.冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

5.用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

6.标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归

方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

【实验记录及结果处理】

根据标准曲线计算出2ml样品液中脯氨酸的浓度,然后换算出样品中脯氨酸的含量（µg脯氨酸/gFW）。计算公式如下：

脯氨酸含量（µg.g-1）＝ c ×(v／a)／w

c为由标准曲线查得脯氨酸含量µg、V为提取液总体积ml、a为测定液体积mL、W为样品质量g，即

脯氨酸含量（μg/g）＝（c × 5 / 2）/样重（g）

（一）、标准曲线绘制

（二）、样品含量测定

不同处理的待测植物根尖质量 2mL样品中脯氨酸吸光值

根据标准曲线计算出2ml样品液中脯氨酸的浓度（μg/ml）（y=0.0347x+0.0052）

换算出样品中脯氨酸的含量（µg脯氨酸/gFW）【脯氨酸含量（μg/g）＝（c × 5 / 2）/样重（g）】

将上表中两组的四个数据浓度求均值

对照：脯氨酸含量＝36.824（µg脯氨酸/gFW）

100mM NaCl处理：脯氨酸含量＝39.501（µg脯氨酸/gFW）

200mMNaCl处理：脯氨酸含量＝29.964（µg脯氨酸/gFW） 5%PEG-6000处理：脯氨酸含量＝119.338（µg脯氨酸/gFW） 15%PEG-6000处理：脯氨酸含量＝43.131（µg脯氨酸/gFW）

【分析及讨论】

1.实验表明，PEG胁迫处理的植株中脯氨酸含量明显高于对照组，Nacl条件下，脯氨酸含量变化不是很明显。

2.非盐性植物在胁迫下，通常降低细胞的渗透势以利于吸水，从而维持整个植物的水势，渗透势的调节可以通过以下两条途径达到：一是植物体内积累一些无机离子和可溶性有机物来降低自身渗透势；二是通过植株叶片气孔收缩，从而降低气孔导度以降低叶片的蒸腾作用，减少水分的丧失。

3.由于脯氨酸具有偶极，性其疏水端与蛋白质连结，亲水端与水分子结合，从而使蛋白质通过脯氨酸束缚更多的水，防止在渗透胁迫下蛋白质脱水，并可防止和减轻由于渗透胁迫而引起酶蛋白的变性。因此脯氨酸的积累在调节细胞的渗透势和稳定蛋白质特性方面有着重要的作用。

4.PEG胁迫的小麦积累了较多的脯氨酸进行渗透调节，降低细胞内的渗透势，从而保持小麦内环境的相对稳定，以致小麦能正常生长，但长势没有对照组的好。