荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量实验报告
荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量
一.实验目的
1.学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。
2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。
二.实验原理
1.荧光光度法原理
(1)常温下,处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态 分子,激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级,再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中,荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系: IF2.303I0bc
当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系: IFKc
这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
(2)荧光分析法的特点:
a. 与紫外-可见分光度法比较,荧光分析法具有更高的灵敏度。
b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱,又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 (3)荧光光谱
激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强度最大。 发射光谱:固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描,找出最大激发光波长,然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描,找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 (4)荧光分析仪器
常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成,如下图所示:
荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点: a.荧光分析仪器采用垂直测量方式,以消除透射光的影响;
b.荧光分析仪器有两个单色器,能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂 散光干扰。
2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量
维生素B2(又叫核黄素,VB2)是橘黄色无臭的针状结晶,其结构式为:
HOHOHOH
H3C
N
HHHH
N
H3C
N
CO
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易分解,对热稳定。维生素B2溶液在430~440 nm蓝光的照射下,发出绿色荧光,荧光峰在525 nm。维生素B2在pH=6~7的溶液中荧光强度最大,在pH=11的碱性溶液中荧光消失,所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。
多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖,其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光,维生素B1本身无荧光,在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光,维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光,他们都不干扰维生素B
2的测定。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素,光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多,故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行。
三.仪器与试剂 970CRT荧光光度计
5 mL吸量管1只,2 mL吸量管1只, 50 mL容量瓶7只 10.0μg·mL-1VB2标准溶液(置阴暗处保存),冰乙酸(AR), 多维葡萄糖粉试样
四、实验步骤
970CRT荧光光度计的基本操作
1. 打开氙灯,再打开主机,然后打开计算机启动工作站并初始化仪器,预热30min 2. 仪器初始化完毕后,在工作界面上选择测量项目,设置适当的仪器参数: 3. 样品测定
(1)标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定:
在6个干净的50 ml容量瓶中,分别吸取0.50、1.00、1.50,2.00,2.50和3.00维生素B2标准溶液,各加入2.00 ml冰乙酸,稀释至刻度,摇匀。得到不同浓度的溶液分别是:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6ug/ml的维生素B2溶液,从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 (2)未知试样的测定:
称取0.15-0.20 g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50 ml容量瓶中,加2.00 ml冰乙酸,稀释至刻度,摇匀。用测定标准系列时相同的条件,平行测量其荧光强度3次
4、退出主程序,关闭计算机,先关主机,最后关氙灯
五.实验结果及数据处理
1.VB2的激发和发射波长
(1)固定发射波长(526nm)扫描吸收波长
(2)固定激发波长(446nm)扫描发射波长
从而确定激发波长为446nm ,发射波长为526nm
2. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。
3.未知样品浓度的测定
称取多维葡萄糖粉0.1074g
维生素B2百分含量= (0.139×50×10-6)/0.1074×100%=0.00647%
六、实验应注意事项
1.使用970CRT时,要按照仪器使用规定使用,不可随意操作。 2.使用比色皿时,要注意勿用手直接触摸比色皿表面,因握住侧棱 七、思考题
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?
答:荧光强度与激发光强度成正比,提高激发光强度,可成倍提高荧光强度。同时,提高仪器灵敏度,也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法,无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度,入射光和出射光同时增大,其灵敏度不变。因此,荧光光度法较吸收光度法灵敏度高。
2. 维生素B2在pH=6~7时荧光最强,本实验为何在酸性溶液中测定?
答:因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射,会发生分解而转化为光黄素,后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此,测量时溶液要控制在酸性范围内,且必须在避光条件下进行。