枯草杆菌转化方法
07-17
枯草芽孢杆菌电转方案（高渗透法）转化
1）接种B . subtilis于5 ml LB培养基中，过夜培养. 。
2）取2.5 ml过夜培养物接入37.5 ml（LB+0.5 M 山梨醇）中（稀释16倍的接种液），37℃，
200 rpm培养至OD 600 nm=0.85~0.95.
3）将菌液冰水浴10 min，然后5000 rpm，5 min，4 ℃离心收集菌体。
4）用10 ml预冷的电转培养基（0.5 M山梨醇，0.5 M甘露醇，10%甘露醇），重新吹悬菌
体，5000rpm ，5min ，4℃离心去上清，如此漂洗4次。
5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml 电转培养基中，每EP 管分装60~65 μl。
6）将60 μl感受态细胞中加入50 ng DNA（1~3 μl），冰上孵育1~1.5 min，加入预冷的电
转杯（1mm ）中，电击一次。
电转仪设置：2.0 kv,1mm, 电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数
7） 电击完毕取出杯子，并立即加入1 ml 复壮培养基RM （LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），
37 ℃，200 rpm，复苏3 h后，涂板。37℃，过夜培养。
前期准备：
（1）准备 40ml （LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10 g/L , 酵母粉5 g/L, NaCl 10 g/L , 3.6 g山
梨醇pH=7.2
（2）100 ml电转培养基（0.5 M山梨醇，0.5 M甘露醇，10%甘油）：9.1 g 山梨醇，9.1 g
甘露醇，10 ml甘油。
（3）20 ml RM （0.5M 山梨醇，0.38M 甘露醇）：1.82 g山梨醇，1.38 g甘露醇。
（4）2个50ml 离心管，灭菌。