基因工程酶与载体

《基因工程原理》作业

1. 同裂酶和同尾酶有何区别？

同尾酶：切割不同的DNA 片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。 同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。

不同的地方：同裂酶识别相同的核苷酸序列，可能切割产生不同的末端；同尾酶识别不相同得核苷酸序列但产生的末端相同。

2. 基因工程常用的各种酶的催化活性与用途。

表1 基因工程常用的工具酶

核酸水解酶

核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶 限制性核酸外切酶 限制性核酸内切酶

核酸合成酶

DNA 聚合酶 RNA 聚合酶 连接酶

核酸修饰酶 其它分子克隆工具酶

甲基化酶 激酶 基因转移酶 磷酸酶

依赖于DNA 的RNA 聚合酶

连接酶 T4多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 核酸酶 核酸酶抑制剂 琼脂糖酶 DNA 结合蛋白

其他酶

表2 基因工程各种工具酶活性及用途

工具酶名称

甲基化酶

活性及用途

生原核物甲基化酶将 DNA 甲基化后，就不被相应的限制酶所切割。Dam 甲基化酶在a 处甲基化。

E.coli DNA聚合酶I

5’→3’外切酶活性（DNA 复制）；

3’→5’和5’→3’外切酶活性（较正和切除）。

Klenow DNA 聚合酶 DNA 聚合酶I 经蛋白酶裂解而从全酶中除去具5’→3’外切酶活性得到的肽段。

T4 噬菌体DNA 聚合酶

来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌；

5’→3’聚合酶活性，效率为pol I的两倍； 3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA 和dsDNA 。

来源于T7 噬菌体 感染的大肠；

5′→3′DNA 聚合酶活性和外切核酸酶活性；

3′→5′外切核酸酶活性为klenow 酶的1000倍。

T7 噬菌体 DNA 聚合酶

Sequenase （测序酶）

切除了 99% 以上的 3‘--5’ 外切活性的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶；

Sequenase Version 2 切除了所有的 3'--5' 外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。

耐热 DNA 聚合酶

分离自水生栖热菌，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性；

主要用于DNA 的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍。

反转录酶

依赖于RNA 的DNA 聚合酶，来自AMV （禽成髓细胞瘤病毒）。

末端转移酶

（terminal transferase）

一种无需模板的DNA 聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA 分子的3' 羟基端；

用于催化DNA 的3' 末端添加同聚物、DNA 的3' 末端标记等。

连接酶 （Ligase ）

连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。

多核苷酸激酶是由T4噬菌体的pseT 基因编码的一种蛋白质，最初也是从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，因此又叫做T4多核苷酸激酶。

催化除去DNA 或RNA 5’-磷酸的反应；

2通过去除5’-磷酸基团，可以防止DNA 片段自首连接，或标记5’端前除去DNA 或RNA 的5’磷酸。

T4 多聚核苷酸激酶 （polynucleotide kinase）

碱性磷酸酶

核酸酶

核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。

抑制的RNase ；

用途：cDNA 合成反应中，如反转录，RT-PCR ，体外转录和体外翻译 。

琼脂糖水解酶，将琼脂糖亚单位水解呈新琼脂寡糖。对热很稳定，反应不需缓冲液；

用于从低熔点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段DNA 或RNA 片段。

协同的和单链DNA 结合而不与dsDNA 结合，维持单链DNA 的稳定。

是指通过切断DNA 的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA 连环数的酶。

可促进dsDNA 对同源ssDNA 的吸收作用，是依赖于DNA 的ATP 酶。

常用的蛋白酶，用于去除残留的酶类及样品中的蛋白质。

是一类水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶。分子克隆中常用的是卵清溶菌酶，用于破碎细胞。

在DNA 或RNA 复制过程中催化双链DNA 或RNA 解旋的酶

在DNA 的修复中起作用，由于DNA 序列中TT 在光照下容易形成嘧啶二聚体，加入光解酶后就可以避免形成二聚体。

是杀伤性T 淋巴细胞和自然杀伤细胞的颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶，引起的细胞凋亡。

水解细胞外基质的蛋白裂解酶，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。

一种人工构建的核酸酶，介导基因定点修饰的酶，如基因的定点敲除。

核酸酶抑制剂

琼脂糖酶

单链DNA 结合蛋白SSB

拓扑异构酶

RecA 蛋白

蛋白酶K

溶菌酶

解旋酶*

光解酶*

颗粒酶B*

基质金属蛋白酶*

ＴＡＬＥＮ核酸酶*

*表示从网上找到的书上没有的新酶

3. 基因工程常用载体

表3 基因工程常用的载体

载体名称

质粒载体

用途

以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选和扩增。

λ噬菌体载体

以λ噬菌体作载体，将外来目的DNA 替代或插入中段序列，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。

单链丝状噬菌体载体 大肠杆菌丝状噬菌体M13、f1和fd 均为单链环状DNA 噬菌体。

M13载体

制备单拷贝，用于测序，定点诱变及合成探针等。由于其重组体趋于不稳定，故这类载体不用作常规克隆的载体。

噬菌粒实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一体的载体；

代表：pUC118和pUC119

噬菌粒

酵母人工染色体载体

模拟酵母菌染色体的复制而构建的载体，是第一个可保持为线性分子的载体，从而模拟了染色体。这样的载体称为酵母人工染色体 。当装载外源DNA 片段后，在酵母菌中可像酵母的染色体一样复制，从而达到克隆大片段DNA 的目的。

细菌人工染色体载体

细菌人工染色体是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体

P1 人工染色体载体

结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。

穿梭载体 （Shuttle vector）

穿梭载体是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。

整合载体 在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体

pYEJ001

一种以pBR322为基础的酵母质粒

昆虫杆状病毒 如核型多角体病毒ACNPV ，昆虫体系的优点是表达效率高，目的基因插入的容量相对大，使用安全等； 目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。

4. 《基因工程》相关章节习题。

第二章

1. 限制性内切酶可划分为哪几个类型，各有何特点？。

限制性内切酶依据酶的亚单位组成、识别序列的种类、是否需要辅助因子分类，可分三类(I, II III) ，

也有分四类,IIs 类, 即II 亚类，其特点如下表。 酶分子 识别位点 切割位点 限制反应与甲基化反应

限制作用是否需用 ATP

Ⅰ

三亚基多功能酶

Ⅱ

Ⅲ

二亚基双功能酶 5-7bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp 同时竞争 Yes

内切酶与甲基化酶 分子不在一起

二分非对称 4-6bp, 大多数为回文对

称结构

无特异性，至少在识别位点外 在识别位点中或靠近识1000bp 别位点 互斥 分开的反应 Yes

No

2. 哪些酶可用于DNA 片段的末端标记？

Pol Ⅰ、Klenow DNA 聚合酶、T4 噬菌体 DNA 聚合酶、T4多核苷酸激酶、末端脱氧核苷酸转移酶。 3.DNA 聚合酶有哪些类型，各有什么活性？。

类型：大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ、Klenow DNA 聚合酶、T4 噬菌体 DNA 聚合酶、T7 噬菌体 DNA 聚合酶、耐热DNA 聚合酶 、反转录酶 、末端脱氧核苷酸转移酶。 结构基因

不同种类的亚基数目 相对分子量 3' →5' 核酸外切酶 5' →3' 核酸外切酶 聚合速度（核苷酸/分） 持续合成能力 功能

DNA 聚合酶Ⅰ polA 1 103000 + + 1000~1200 3~200

切除引物，修复

DNA 聚合酶Ⅱ polB ≧7 88000 + - 2400 1500 修复

DNA 聚合酶Ⅲ polC(dnaE) ≧10 83000 + -

15000~16000 ≧500000 修复

4. 分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？

限制性内切酶作用底物：识别和切割双链DNA 分子中某种特定核苷酸序列。

连接酶作用底物：将双螺旋DNA 分子的某一条链上两个相邻核酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口封闭起来。

修饰酶作用底物：能催化稀有碱基参入RNA 或DNA ，或对原有碱基进行修饰，以防止限制性内切酶的破坏。。

第三章

1. 作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？

将外源DNA 或基因携带入宿主细胞并能自我复制的工具称为载体。

作为一个最基本的克隆载体，它必须具备复制起点、酶切位点、筛选标志；作为一个最基本的表达载体，必须具备的功能元件有启动子、酶切位点、转录终止序列、筛选标志、原核表达载体和SD 序列。

2、作为α-互补，在载体构建中有何作用？

α-互补：是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现的功能互补而建立的。将缺失编码的第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶基因称为lacZ △M15基因，将半乳糖苷酶基因的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N 段140个氨基酸的序列称为lacZ ’。这两个基因的产物单独存在是都无酶活性，但混合之后却有酶活性。在载体上加lacZ ’，在受体菌中引入lacZ △M15基因，IPTG 作为诱导物，底物X-gal 被β-半乳糖苷酶分解后可以产生蓝色。如果质粒载体中插入外源基因，则不能产生互补，不可能产生蓝色。白色菌落是含有插入外源DNA 的重组质粒，因此可利用菌落颜色变化来筛选插入外源DNA 的重组质粒。 这种方法是根据组织化学的原理还筛选重组体的。主要是在γ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，重组成功则形成白色菌斑，非重组噬菌体则形成蓝色菌斑。

3. 请简要描述λ噬菌体溶源状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用

当噬菌体DNA 进入宿主细胞后，其两端的互补单链通过碱基配对形成环状DNA 分子，后在宿主细胞的DNA 连接酶和旋促酶作用下形成封闭的环状DNA 分子充当转录的模板。噬菌体进入溶原状态或是裂解生长状态。

作用：λ噬菌体可作为基因工程操作中的载体，用于目的基因的克隆和储存。其溶源状态为该作用提供了基础。

4．λ 噬菌体发育调节

（1）感染周期：吸附、立即早期转录、延迟早期转录、溶原和裂解的感染分化、进入裂解生长、溶源化。

（2）克隆原理

λ噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA 片段。构建cDNA 文库和基因组文库，并从中筛选目的基因是λ噬菌体载体的一般用途，也可以用于亚克隆在大容量载体（如粘粒载体）中增殖的外源DNA 片段。

（3）克隆步骤（噬菌体克隆外源目的基因）

通过裂解过程增殖载体回收、纯化载体；载体与外源DNA 的酶切；载体与外源DNA 连接；重组噬菌体的体外包装；包装噬菌体的感染﹙infect ﹚；筛选。

5. 简单描述M13KO7辅助噬菌体的遗传学特征和生物学功能及其在制备单链DNA 中的作用。

遗传学特征：是M13的衍生株，大小为8.7kb ，带有来自p15A 质粒的复制起点。还带有一个来自转座子Tn903的卡那霉素抗性基因，用作选择标记。基因Ⅱ带有一个G-T 的突变，导致该基因蛋白的第40位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。

生物学功能：当M13KO7感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，进入宿主细胞内的单链DNA 在宿主细胞内酶的作用下转变为双链，后者可在质粒p15A 的复制起点控制下进行复制。由于细胞内M13KO7双链DNA 的积累并不需要噬菌体基因产物的作用，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的M13KO7噬菌体基因组的早期复制。M13KO7基因组双链DNA 可表达产生子代单链DNA 所必需的所有蛋白。但M13KO7中突变的基因Ⅱ产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUC118和Puc119中噬菌体复制起点的作用有效，这就使得噬菌粒正链DNA 能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA 能够占据优势。当不含噬菌粒的宿主菌被M13KO7感染后，突变Ⅱ基因产物则完全可与自身的残缺复制起点作用，并产生足够量的M13KO7噬菌体，以作为产生噬菌粒单链DNA 的种子。

第四章思考题

1. 大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？

种类：粘粒载体（cosmid ） 、酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome ,YAC） 、细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome,BAC）、P1噬菌体载体和P1人工染色体载体（P1 artificial chromosome ,PAC），其特点如下表所示。 载体

容量(kb) 复制子

宿主

拷贝数

重组DNA 导

入宿主的方式 转导 转导 电转化

筛选标记

克隆DNA 获取方法 碱抽提 碱抽提 碱抽提

黏粒 P1 PAC 30-45 70-100 130-150 ColE1 P1 P1 E.coli 高 E.coli 1 E.coli 1 - sacB sacB

BAC YAC 120-300 250-400 F ARS E.coli 1 yeast 1 电转化 转化 a-互补 ade2 碱抽提 脉冲场电泳

2. 简述利用YAC 克隆载体构建基因文库的原理。

YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。 当用 BamHⅠ切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。 YAC 的转化过程

(1)宿主酵母菌： trp- 和 ura-；

(2）选择方式:只有同时得，才能在基本培养基（不加TRP 和URA ）上生长。 对于 BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。

3.BAC 克隆载体有哪些显著优点？

BAC 与 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体 ）相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb。

第五章

1. 以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？

大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。

大肠杆菌表达载体应有的结构成分：复制起始点；抗性基因；多克隆位点；表达系统元件。 2. 简述利用T7噬菌体启动子的pET 系列表达载体的工作原理。

表达载体pET-5a 是典型的pET 载体（见下图）其组成是在载体的基本结构上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶且位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。

T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体RNA 聚合酶识别并启动转录，而大肠杆菌的RNA 聚合酶不能作用于T7噬菌体启动子。因此要求用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA 聚合酶。 3. 何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？

穿梭载体（Shuttle vector ）：是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。

遗传结构特点：至少含有两套复制单元和两套选择标记。

第六章

1. 印迹分子杂交有哪些类型，并说明在什么情况下需要使用这些方法。

印迹分子杂交根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交(DNA-DNA)、Northern 杂交(DNA-RNA)和 Western 杂交(蛋白质和蛋白质) 等, 以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。

（1）Southern blotting：检测混合样品中特定DNA 分子是否存在，以及其分子量大小。

（2）Northern 印迹杂交：检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。 （3）Western 印迹杂交：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。 （4）原位杂交：用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，

再通过 Southern 杂交进一步验证。

（5）斑点杂交 ：将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交以检测目的核酸。

2. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？

DNA （或 RNA ）探针的标记方法很多，主要有均匀标记、单链探针标记、末端标记，不同的标记方法适用于不同的分子，标记方法不同要求的工具酶也不一样。常见的标记物有放射性同位素和生化酶两种。 （1）均匀标记

是指间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标记的

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核苷酸（如 [α- P]dATP），从而使整个新分子被均匀地标记。 ①缺口平移标记（Nick Translation）：这种标记方式目前只有通过大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 来完成，只有该酶具有 5'-3' 外切活性。通过在待标记的 DNA 分子上产生切口，该酶引发 5'-3' 外切反应，在随后的 5'-3' DNA 聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸 （dNTP ），新合成的核酸链就带有标记物。

②缺口平移法 ：利用体系中 DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性、5’ → 3’的聚合酶活性的两种作用随机掺入标记单核苷酸，从而使新合成的核酸链带有标记物。在整个标记反应体系中，待标记的 DNA 分子的任何一条链中的任何位点（除靠近 5 ’端外）都可能作为标记反应的起始点，并持续到该链的 3’ 末端。因此，新合成的被标记的分子可以代表该待标记的 DNA 分子的绝大部分核苷酸序列。

③随机引物标记：利用由 6 个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在 Klenow 酶的作用下对目标 DNA 进行随机扩增。在扩增中加入标记的 dNTP ，扩增出来的 DNA 产物就可用作探针。该方法多用来标记一个 DNA 片段。 ④PCR 扩增标记：在PCR 扩增时加入标记的 dNTP ，不仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩增，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。 （2）单链探针标记

①单链 DNA 探针：单链 DNA 探针是通过单链模板来制备的。首先将待标记的双链 DNA 连接到 M13 噬菌体载体或噬菌粒载体上，制备其单链 DNA , 然后以单链 DNA 为模板, 以对应于载体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物，在有标记的 dNTP 存在下，通过 Klenow DNA 聚合酶合成单链 DNA 。经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链 DNA 探针。 ②单链 RNA 探针 ：将待标记的 DNA 片段插入载体的多克隆位点，在转录区下游选择一个酶切位点，用限制性内切酶将载体线性化以防止转录出载体的序列和多联体产物。加入对应的噬菌体 RNA 聚合酶， rNTP 和某个标记的 rNTP 在体外进行转录，合成出标记的单链 RNA 。 （3）末端标记

①末端标记：直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加入标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行标记，亦称末端标记。

DNA 片段的末端标记：末端标记主要通过酶促反应来完成，如 Klenow DNA 聚合酶和 T4 或 T7 DNA 聚合酶在对 DNA 片段进行末端补平反应或平末端的置换反应时可引入标记的核苷酸。

②寡核苷酸的标记：合成的寡核苷酸主要通过 T4 多核苷酸激酶在 5' 末端引入标记的磷酸基团进行标记，也可利用末端转移酶在 3' 末端连接标记的核苷酸。