不同时间运动骨骼肌AMP/ATP比值及AMPK活性的变化特点

　　摘要：目的：研究不同时间一次性运动大鼠腓肠肌AMP、ATP含量及AMPK活性，旨在阐明不同时间运动AMPK的变化特点及机制。方法：62只雄性SD大鼠分为4大组：安静对照组（n=8）、30 min运动组（n=18）、60 min运动组（n=18）、90 min运动组（n=18），其中运动组又各分为3小组（n=6），分别在运动后即刻、1 h和6 h取材。运动速度18 m/min，坡度10%。结果：和安静组相比，各组ATP运动后无显著改变；AMP在60和90 min运动后即刻显著升高（0.183，0.212 Vs 0.158，P　　关键词：AMPK；AMP/ATP比值；运动时间；骨骼肌� 　　中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)06-0776-03� 　　 　　5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5′-AMP activated protein kinase , AMPK）称为细胞能量感受器，对运动骨骼肌能量代谢发挥着重要调控作用［1-2］。本实验研究不同时间运动AMP/ATP比值的变化特点及与AMPK活性的关系，探讨AMPK活性变化的分子机制。实验假设运动能以时间依赖方式激活骨骼肌AMPK，其机制与AMP/ATP比值的升高有关。 　　� 　　1材料与方法 　　 　　��1.1动物分组�62只8周龄健康雄性SD大鼠，购进时平均体重(187±14)g，由北京大学医学部实验动物中心提供。昼夜节律人工控制光照（光照时间为07：00-19：00），环境温度(23±2)℃，自由饮食。� 　　大鼠随机分为4大组：安静对照组（n=8）、30 min运动组(n=18)、60 min运动组(n=18)、90 min运动组(n=18)。除安静组外，其余各组又分为3个小组，每小组各6只，分别在运动后即刻(0 h)、1 h、6 h取材。取材前动物用乌拉坦腹腔麻醉（0.8 mL/100 g体重）后，速取右后肢腓肠肌的白肌部分（位于腓肠肌外侧浅层）投入液氮中保存。� 　　 　　1.2运动方案�运动动物先进行6 d适应性训练，方法如下：前三天分别以10 m/min、15 m/min、20 m/min的强度和10 min、20 min、30 min的时间进行递增负荷和时间跑台运动，后3 d固定于20 m/min的强度和30 min的时间进行运动，坡度均为10%，每天一次，在上午9:00-10:00进行，周日休息。适应性训练结束后，动物进行一次性运动。速度18 m/min，坡度10%，相当于65%V・O�2max强度，时间分别为30、60、90 min。 　　�1.3测试方法AMP、ATP含量测定使用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。样品前处理过程：称取肌组织100 mg，剪碎后加入0.9% NaCl（内含0.5 mM EDTA-2Na）制成10%匀浆液，取0.5 mL匀浆液加入0.5 mL 3% HClO�4，4℃下沉淀蛋白，3 000转/min4℃离心10 min，取上清液0.5 mL加入20% KOH 40 μL， 4℃静置30 min，11 000转/分5 min离心，取上清200 μL -80℃保存待测。色谱条件为：日本Dikma公司ODS-3反相柱(250×4.6 mm) ，流动相为50 mmo1/L磷酸钾缓冲液，调pH至6.5，等比洗脱，流速为1.2 mL/min，检测波长254 nm，柱温20℃，进样量20 μL。� 　　AMPK活性的测定采用放射性同位素方法。即根据AMPK使特异性肽底物SAMS（氨基酸序列为HMRSAMSGLHLVKRR）磷酸化的原理，以［γ-32P］ATP作为磷供体检测酶的活性。按照Shin Terada［3］和Seung Hun Cha［4］提供的方法进行。AMPK活力单位： 30℃条件下，每分钟将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。 　　�1.4统计处理数据分析均采用SPSS13.0统计软件进行。计量资料用均数±标准差（X±SD）表示。计量资料的组间比较采用单因素方差分析，显著性水平取P　　� 　　2结果 　　 　　��2.1不同时间运动腓肠肌AMPK活性的变化与安静组相比， 各组运动后即刻显著升高（P　　 　　�2.2不同时间运动腓肠肌AMP含量的变化�与安静组相比，60、90 min组运动后即刻显著升高（P　　 　　2.3不同时间运动腓肠肌ATP含量的变化各组间比较均无显著性差异(表4)。� 　　 　　2.4不同时间运动腓肠肌AMP/ATP比值的变化与安静组相比，60 min组运动后即刻显著升高（P　　 　　2.5不同时间运动后即刻AMPK活性与AMP/ATP比值相关分析�结果见图1。� 　　 　　3讨论与分析 　　�� 　　有关运动时间对AMPK活性影响的研究甚少。Fugii等以45% V・O�2max强度长时间运动至力竭导致AMPKα2活性增高，但若以该强度运动时间较短时则不升高［5］。Stephens TJ等发现，受试者以62.8%±1.3% V・O�2max强度蹬自行车运动时，第5 minα2活性增加2倍，到第30 min上升到3倍，同时ACCβ磷酸化分别增加18倍和36倍［6］（ACCβ常作为AMPK活性变化的间接指标）。以上文献只研究了α2亚基，迄今尚未见有关α1与运动时间关系的报道，所以，AMPK信号与运动时间的关系目前尚不清楚。� 　　本实验采用总AMPK活性研究AMPK的激活与运动时间的关系，结果表明，运动30、60、90 min运动均能激活腓肠肌AMPK，随着运动时间的延长，AMPK活性持续升高，提示AMPK的激活具有时间依赖性。最近对2型糖尿病患者的研究发现，持续40 min的中等强度运动（70%V・O�2max），运动第10 min和40 min分别进行肌肉活检，发现对照组（健康消瘦者）α1活性不改变，而α2活性持续升高［7］。本实验结论与之相同，因为二者的运动强度和时间都较为相近。一般认为，α1和α2在运动中的激活不完全一致。由于总AMPK的活性主要取决于α2亚基（骨骼肌尤其如此），所以，α2亚基活性在不同时间中的变化特点应该与总AMPK活性基本一致，我们的研究对此予以了证实，从而表明α1亚基活性对总AMPK活性而言可能并不重要。�

　　实验对调控AMPK活性的主要分子机制AMP/ATP比值在不同时间中的变化同步进行了研究。三组ATP在运动后即刻均无显著下降。AMP在30 min运动无显著增加，60和90 min运动出现显著性增加，相应地，AMP/ATP比值在运动后60和90 min有显著升高。对不同时间运动AMPK与AMPATP比值相关分析发现，运动后即刻呈显著正相关（r=0.67）。以上结果表明不同时间运动AMPK的激活主要由AMP/ATP比值升高所调控。本实验未发现30 min运动AMP的增加，Matthew报道人体以60%V・O�2max强度持续运动，在第10 min骨骼肌游离AMP（AMPfree）即由安静时的(0.32±0.12)mol/kg D.M升至(2.51±1.08)mol/kg D.M，并在随后的时间中持续增加［8］。本研究与之出现差异的原因可能与测试指标不同有关，总AMP的变化没有AMPfree的变化敏感。� 　　对比AMPK与AMP的增加幅度发现， 二者的增幅相差较大，即AMP的变化相对平缓，AMPK的变化更为急剧。分析出现这种差异的原因可能是：一方面，AMPK对AMP浓度的变化极为敏感，AMP浓度的较小变化都能引起AMPK的明显变化；另一方面，AMPK活性的变化主要受AMPfree而非总AMP的影响，本实验测得的总AMP的变化虽然不大，但事实上，AMPfree的变化可能已经很大，总AMP的微小变化不能完全反应出AMPfree极大变化的真实情况，这应该是总AMP指标的不足之处。另外，也不能排除AMP非依赖性机制对AMPK的作用。� 　　实验发现，运动后恢复期AMPK活性下降缓慢，60和90 min运动后1 h仍高于安静水平，6 h才恢复正常，而AMP/ATP比值下降极为迅速，1h即已完全恢复，二者的恢复时程并不一致。分析其原因可能是，一方面AMPK被激活后，其恢复速度本身慢于AMP/ATP，另一方面，AMP/ATP比值恢复后其他因素仍在维持AMPK活性，如运动后体内酸性产物清除较慢、运动后过量氧耗等。此外，应关注非AMP/ATP依赖性机制的作用，如Ca2+/CaMKK信号通路也可以激活AMPK［9-10］，虽然研究认为这一机制不起主要作用［11］，但在运动后恢复期，随着AMP/ATP作用的消失，其作用可能反而更为突出，对此尚需进一步研究。� 　　运动中AMPK的激活应该是强度和时间作用效应的综合，在分析时不能将二者割裂开来。本实验采用的强度是中等强度，相当于65%V・O�2max。运动强度和时间对AMPK活性的影响哪个更重要？结合前人的研究似乎可以做出某种似乎合理的推测：Stephens TJ让受试者以62.8%±1.3% V・O�2max强度运动至第5 min即发现AMPK活性显著升高［6］，而Fugii的受试者以45% V・O�2max强度运动至力竭才观察到AMPK活性增加［5］，对比两实验不难看出运动强度较时间对AMPK的影响更大。本课题组在研究AMPK与运动强度的关系时，发现运动后即刻二者的相关系数为0.89（将另文发表），高于本研究运动时间与AMPK的相关系数0.67，似乎也印证了这一判断。分析其原因，可能是ATP分解的速率主要受强度而不是时间的影响，骨骼肌ATP的变化在一定的强度下，随时间的延长带来的积累效应可能并不显著。当然，鉴于强度和时间对AMP的影响孰大孰小尚不清楚，毕竟AMP相对ATP而言对AMPK的作用更为关键，所以上述推测还需实验支持。� 　　本实验采用30、60、90 min三种运动时间进行研究，尚不能完整地分析不同运动时间对骨骼肌AMPK活性变化影响的规律。首先，AMPK活性的升高并非随着运动的开始立即显现，而要经过一定时间，尽管此时间可能很短暂［6］。由于本实验30 min 即见AMPK活性显著性升高，所以无法得知AMPK活性出现显著变化的最初时间。其次，随着时间的持续，AMPK活性是持续上升？还是升高到某一水平后稳定不变？还是升高到一定的程度后开始下降？目前都还不清楚。Clark报道以45%V・O�2max强度运动至力竭时，导致α2活性升高［12］，而Mcconell报道长期次最大强度（64%V・O�2max）自行车运动削弱α1和完全抑制α2活性［13］。当然，以上报道都还无法对上述问题给予回答，所以，今后需要进一步展开研究。� 　　� 　　4结论 　　�� 　　骨骼肌AMPK在运动中的激活具有时间依赖性，其机制与AMP/ATP比值升高有关。由于以65%V・O�2max强度进行不同时间运动未降低骨骼肌ATP含量，所以 AMP/ATP比值的升高仅受AMP升高的影响。运动后AMP/ATP的恢复快于AMPK的恢复。� 　　� 　　参考文献： 　　［1］ Kola B, Hubina E, Tucci SA, et al. Cannabinoids and ghrelin have both central and peripheral metabolic and cardiac effects via AMP-activated protein kinase［J］. J Biol Chem,2005,280(26):25196-25201.� 　　［2］ Aschenbach WG, Hirshman MF, Fujii N, et al. Effect of AICAR treatment on glycogen metabolism in skeletal muscle［J］. Diabetes,2002,51(3):567-573. � 　　［3］ Shin Terada, Masahide Goto, Miyuki Kato, et al. Effects of low-intensity prolonged exercise on PGC-1 mRNA expression in rat epitrochlearis muscle［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,296(2):350-354.� 　　［4］ Seung Hun Cha, Zhiyuan Hu, Shigeru Chohnan, et al. Inhibition of hypothalamic fatty acid synthase triggers rapid activation of fatty acid oxidation in skeletal muscle ［J］. PNAS,2005,102(41):14557-14562.� 　　［5］ Fugii N, Hayashi T, Hirshman MF, et al.Exercise induces isoform-specific increase in 5′AMP-activated protein kinase activity in human skeletal muscle［J］. Biochem Biophys Res Commun,2000,273(3):1150-1155.� 　　［6］ Stephens TJ, Chen ZP, Canny BJ, et al. Progressive increase in human skeletal muscle AMPKalpha2 activity and ACC phosphorylation during exercise［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab，2002,282(3):688-94.�

　　［7］ Apiradee Sriwijitkamol, Dawn K. Coletta, Estela Wajcberg, et al. Effect of Acute Exercise on AMPK Signaling in Skeletal Muscle of Subjects With Type 2 Diabetes: A Time-Course and Dose-Response Study［J］. Diabetes,2007,56(3):836-848.� 　　［8］ Matthew J. Watt, George J. F. Heigenhauser, Marcus O'Neill, et al. Hormone-sensitive lipase activity and fatty acyl-CoA content in human skeletal muscle during prolonged exercise ［J］. J Appl Physiol,2003,95(1):314-321.� 　　［9］ Hawley SA, Pan DA, Mustard KJ, et al. Calmodulin-dependent protein kinase kinase β is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase［J］.Cell Metab,2005,2(1):9-19.� 　　［10］ Hurley RL, Anderson KA, Franzone JM, et al. The Ca2+/calmodulin-dependent 　　protein kinase kinases are AMP-activated protein kinase kinases［J］.J Biol Chem,2005,280(32):29060-29066.� 　　［11］ Sakamoto K, McCarthy A, Smith D, et al. Deficiency of LKB1 in skeletal muscle prevents AMPK activation and glucose uptake during contraction［J］.EMBO J,2005,24(10):1810-1820.� 　　［12］ S. A. Clark, Z.-P. Chen, K. T. Murphy, et al. Intensified exercise training does not alter AMPK signaling in human skeletal muscle［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab,2004,286:737-743.� 　　［13］ Mcconell GK, Stepto NK, Chen ZP, et al. Short-term training suppresses increases in human skeletal muscle AMPK activity during prolonged exercise［J］. Diabetes,2002,51(2):253-254.