急性肾损伤时水通道蛋白2及钠钾泵的效果分析

　　危重患者特别是合并严重感染者极易出现多器官功能障碍综合征MODS，而肾脏是最易受影响的器官之一。MODS发生肾损伤时，由于肾损伤后继发的严重水电解质酸碱平衡代谢紊乱，导致病情进展迅速，病死率明显增加[1 4] 。水通道蛋白2 aquaporin 2，AQP2在肾脏表达，通过加压素vasopressin，AVP对集合管水通透性进行调节，在肾脏水代谢中发挥了重要的作用[5] 。AQPs是水和尿素跨膜主动转运机制的结构基础， AQP2异常表达可导致多种先天性或后天性肾脏疾病。肾脏钠钾三磷酸腺苷酶Na+K+ATPase，又称钠钾泵，其功能的异常与疾病的严重程度呈正相关，且功能的恢复先于疾病的好转，这对疾病病情及预后的判断有重要意义[6 7]。本实验通过研究大鼠AQP2及Na+K+ATPase的表达特点，从分子水平及能量代谢方面研究肾损伤的可能的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　选取健康大鼠72只，随机随机数字法分为对照组24只，内毒素组48只，采用大鼠腹腔注射脂多糖LPS5 mgkg造成内毒素致多器官功能障碍动物模型。对照组仅作假手术处理，各时间点每组LPS组8只，对照组4只。对照组以及LPS组于术后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d分别处死动物，留取尿量。在各个时间点，乙醚麻醉大鼠，取下一侧肾脏，80℃低温保存，用于做RTPCR。腹主动脉取血，离心取血清测定肌酐、尿素氮。用预冷的0.01 molLPBS缓冲液冲洗另一侧肾脏，肾脏颜色变白后，用10%中性缓冲福尔马林灌注固定肾脏，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 mm。以备苏木素、伊红HE染色和免疫组化染色。经腹主动脉取出的血，1000 rmin，20 min离心，留取血清，20℃保存，用于检测生化指标，确定肾功能损伤程度。取肾脏所用器械、耗材均经高温或DEPC处理。 论文网 lW54

　　1.2主要试剂

　　Wales 雄性大鼠均于吉林大学动物试验室，体质量203.511.7g，mRNA试剂盒杭州新景生物试剂开发有限公司，Na+K+ATPase 试剂盒杭州新景生物试剂开发有限公司，AQP2抗体Santa Cruz. Biotechnology.lnc，美国，脂多糖北京中生瑞泰科技有限公司。

　　1.3检测方法

　　1免疫组织化学染色测定肾脏AQP2蛋白表达 按照常规10%甲醛液固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片片厚2 pm，按试剂盒说明步骤染色封片，通过图像采集软件和图像分析软件进行计算机图像分析，阳性结果呈绿色颗粒，每张切片随机取10个高倍视野，测定阳性部分平均光密度值，分析AQP2蛋白表达程度。

　　2RTPCR测定肾脏AQP2mRNA表达 AQP2引物通过基因库查找基因序列，设计引物序列为 上游引物 5GCTGTGGCGTTGTTGTGGAG3，下游引物 5AGTGCTGGCTGAGTTCTTGG3，扩增片断长度

345 bp。GAPDH引物 上游引物 5GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3，下游引物 5AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3 扩增片段长度616 bp。取约40 mg肾组织用Trizol试剂盒提取总RNA，采用一步法进行RTPCR反应， PCR产物电泳后用凝胶成像分析系统紫外分光成像，记录积分光密度值。用actin mRNA为内参照进行校正，各样本的基因表达量用该样本扩增后产物在凝胶上条带的光密度值与actin基因条带的光密度值之比半定量表示。 作文 Lw54zuowen

　　3肾脏形态学检查 HE染色，切去肾脏髓质组织，10%甲醛固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋切片，HE染色，用100倍光镜观察。

　　4肾小管上皮细胞Na+K+ATPase测定 取10 mg小鼠肾皮质同时取部分组织病理切片验证为肾小管，称取组织其质量，按质量体积比加9倍生理盐水制成10%的匀浆。1500 rmin离心10 min，取上清0.2mL加0.8 mL生理盐水稀释成2%的匀浆。以96孔板法测定样品蛋白含量，测得各样品光密度值，以光密度值分别减去空白光密度值为横坐标，对应的标准品浓度为纵坐标做图，得出其标准曲线，最后计算测得的各样品得出浓度mgmL。按照Na+K+ATPase试剂盒说明书，取上清液测定Na+K+ATPase活性。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 17.0统计软件进行处理。计量资料采用均数标准差xs表示，各组数据平均数之间的差异采用成组t检验，以P0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 尿量变化

　　LPS组大鼠尿量早期12 h、24 h减少，后期2 d、3 d、5 d较对照组明显增多。见表1。2.2 肾功能的变化

　　LPS组大鼠肌酐、尿素氮水平逐渐增高，在48 h达高峰，此后逐渐降低，但仍高于对照组。见表2。2.3 肾脏的病理学特点 总结大全 hTmlzongjie

　LPS组大鼠肾脏病理切片可见明显的肾小管上皮细胞肿胀，肾小管管腔变小。肾小球细胞肿胀，炎症细胞浸润。

　　2.4 肾脏组织AQP2 mRNA及蛋白表达

　　LPS组大鼠肾小管上皮细胞AQP2 mRNA表达在6 h时增高，但随后迅速降低，在48 h降至最低，随后逐渐增高。LPS组大鼠肾脏组织在实验12 h出现肾小管上皮细胞AQP2蛋白表达减少，在48 h肾脏AQP2蛋白表达减少最为明显，此后逐渐增加。见表3和表4。

　　3 讨论

　　目前认为，多器官功能障碍综合征主要是因机体炎症反应失控所导致的多器官功能序贯性损伤，多种炎症介质的参与是其发病的关键，其中肾脏是最易受损伤的器官之一。早期人们认为脓毒症导致的肾损伤是由肾脏缺血及再灌注损伤时造成，随着研究的进展发现，脓毒症患者肾脏皮质血流未见明显下降时已经出现肾损伤[8]，因此炎症介质对肾损伤的作用受到了广泛[910]。

　　近年来研究发现，水通道蛋白是在全身广泛分布的一组蛋

白，其表达的异常与多种疾病的发生及发展密切相关。目前已经发现在肾脏表达的水通道蛋白为AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP6、AQP7、AQP11。其中，AQP1主要在肾脏的近曲小管顶端和基底膜表达，在ADH调节有关的集合管几乎没有分布，主要与肾脏水分子的基础重吸收功能有关[11]。AQP2在肾脏含量最多，在肾脏集合管的大多数细胞表面都有表达，是受ADH调节的水通道蛋白。基础状态下，AQP2储存在囊泡中，但是一旦有ADH刺激，通过蛋白激酶A途径使AQP2磷酸化，AQP2迅速翻转到细胞膜的表面，成为浓缩尿液的水通道[1213]。AQP3与AQP4在肾脏集合管的基底外侧表达，帮助水分子穿过集合管[1415]。AQP6主要在集合管的能够分泌酸 思想汇报 sixianghuibao