核算及蛋白质检测技术

核酸的凝胶电泳:

1. 基本原理：

生物大分子在一定pH 条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。

在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA 和RNA 多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA 片段的基本原理。

琼脂糖凝胶电泳:

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA 片段的制备电泳。

琼脂糖凝胶分辨DNA 片段的范围为0.2～50kb 之间; 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1～1000bp 之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp 的DNA 小片段，而若要分离1000bp 的DNA 片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp 的双链DNA 分子，而分离大片段DNA 就要用低浓度(0.3%～1.0%)的琼脂糖凝胶。

在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidium bromide ，简称EB) 染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA 带中含0.05μg 的微量DNA ，可以清晰地检测出来。EB 能插入到DNA 或RNA 分子的相邻碱基之间(图5-4) ，并在300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。把EB 直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA 分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA 分子能吸收EB 并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA 片段的数量成正比。

核酸的分子杂交:

将特定的单链DNA 或RNA 混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，

所形成的双链分子就被称

为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA 分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

一.Southern blotting

在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA 或RNA 分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地" 吸印" 上去的，因此，核酸杂交也被称为"DNA 印迹杂交" 。由于该方法是E·M·Southern 于1975年首先设计出来的，所以又叫做Southern blotting。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。 核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（印迹转移）；第二，将滤膜与DNA 或RNA 探针进行杂交。具体步骤：1、转移。2、在80℃下烘烤1～2h 或用紫外线交联法将DNA 片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜上的单链DNA 杂交之后，就很难再解链。4、用漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测2ng ；为了安全，我们用DIG （地高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号 。

基因组DNA 被限制性内切酶酶切为DNA 片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带；（c ）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作用将凝胶上的DNA 条带原封不动地" 吸印" 到滤膜上去。（d ）在80℃下烘烤1～2h 或用紫外线交联法将DNA 片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。(e) 滤膜放入带标记的DNA 或RNA 核酸探针溶液中进行核酸杂交。

二.Northern blotting

Northern 印迹杂交是检测特定基因是否转录和转录的强弱情况。它不但用于基因工程中检测目的基因的转录情况，而且也广泛用于功能基因调控的研究。具体方法是从细胞中提取mRNA ，经电泳将不同大小的mRNA 分子分开后，印迹转移于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与特定的探针DNA 杂交后，洗去未杂交上的标记探针DNA 。经放射自显影显带，根据带密度的强弱就可确定其表达的相对值。 1979年，J.C.Alwine 等人发展而来，是将 RNA 分子 从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern 印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern 印迹杂交技术（Northern blotting）。

Northern 杂交原理

将变性的RNA 或mRNA （用甲醛、乙二醇，防止RNA 形成二级结构）用琼脂糖胶电泳分离，转移吸印到特殊（叠氮化的或其它化学修饰的）的活性滤膜或滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起，与标记的探针RNA 或DNA 杂交，然后放射自显影以分析RNA （大小、数量）的方法，这种方法同萨瑟恩的DNA 印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺塞恩RNA 吸印杂交技术（Northern blotting ）。

三． Western blotting:

（1）概念: 将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I 标记的特定蛋白质的抗体进行反应，

这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技

术（Western blotting）。

（2）原理：蛋白质印迹(Western blotting) 是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。

（3） 蛋白质印迹步骤：

1、固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。

2、封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上, 并与蛋白质反应。

3、初级抗体(第一抗体) 是特异性的。

4、第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。

5、适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。 免疫共沉淀法分离蛋白质 ：

细胞提取物直接与针对该蛋白的抗体混合。同时加入另一种与抗体结合的蛋白，它能使抗体发生聚集，那些与抗体结合的细胞提取物中的蛋白也会因此而聚集在一起。这种抗体与目标蛋白之间的聚集会产生沉淀。该沉淀可以用凝胶对目标蛋白进行鉴定。

DNA 芯片

一种生物的几千个基因以独特的方式被体现在一块小的芯片上，每个基因占据一个点。每个点含有一种高浓度的寡聚物，它只与对应的基因互补。之后从处于一种条件下的细胞中提取mRNA 。通过反转录将mRNA 转变成DNA 并带上红色标记。然后，从处于另一条件下的细胞中提取mRNA 。将此mRNA 转变成DNA 并

带上绿色标记。

蛋白质定位

确定某种蛋白在细胞中位置的最有效方法是让该蛋白带上荧光标记或放射性标记。荧光蛋白暴露在一定波长的光下时能发射出不同波长的光，这种光能用特殊的显微镜在很高的放大倍数下进行检测。让蛋白质带上荧光标记最通行的方法是将它与一个小的荧光蛋白融合（图D.19）。常用的是绿色荧光蛋白（GFP ）。可以应用基因工程的方法将任何基因与GFP 基因进行组合。当这样的重组基因在细胞中表达的时候，该基因的蛋白质将与GFP 融合在一起。一般情况下，GFP 是挂在该蛋白的一个末尾上，不会明显地改变该蛋白的功能。

蛋白质位置的测定。（a ）制备融合蛋白。（b ）用GFP 做标签使蛋白质的亚细胞位置可见。

酵母双杂交：

用来检查两种蛋白之间的结合。转录激活蛋白是模块化的蛋白，它们具有一个DNA 结合结构域，又有一个分开的激活转录的功能域。在激活一个基因的转录时，这两个域都是需要的。在双杂交分析中，将一种供试蛋白与某种激活蛋白的DNA 结合域融合。而将另一种供试蛋白与该激活蛋白的激活域融合。之后让两种蛋白都在具有一种报告基因的酵母细胞中表达。如果该报告基因受到激活蛋白的刺激，它能产生一种信号（一般是某种颜色）。两种融合蛋白中的任何一种都不能够激活转录。但是，如果这两种供试蛋白能够互相结合在一起，那么DNA 结合域就能与转录激活域连接在一起。这样，这种重新组织起来的激活蛋白就能够启动报告基因的转录。

蛋白质双向电泳-2-DE 技术

蛋白质2维电泳 1个方向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶 主要是把蛋白质按照分子量分开 1个方向是等点聚焦 把蛋白质按照等电点的不同分开 这样就可以把不同的蛋白质尽可能的分开 可以结合质谱对细胞进行蛋白质组的研究 例如我们研究癌细胞和癌旁细胞 利用这个方法就可以知道 两种细胞都有哪些蛋白质表达的不同。

等电聚焦

通过10000V 高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦

步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持

聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH 范围和胶条长度来确定。

胶条平衡

等电聚焦结束后进行SDS-PAGE 电泳之前需进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS 充分结合，保证SDS-PAGE 电泳的顺利进行

步骤：一般采用两步平衡法，用含SDS 、DTT 、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT 后再平衡一次

SDS-PAGE 电泳

使得蛋白质按照分子量的大小不同而分离，与普通SDS-PAGE 相似

在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩 蛋白质检测

硝酸银染色：

优点：灵敏度高，

缺点：重复性差，质谱兼容性低

考马斯亮兰染色：

优点：重复性好，质谱兼容性高

缺点：灵敏度低

荧光染色：

优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高

缺点：价格贵

其它染色方法：

胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等

基因扩增：

聚合酶链式反应，即PCR 技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA 片段扩增数十万乃至千百万倍。

PCR 技术的原理

首先将双链DNA 分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA 分子，DNA 聚合酶以单链DNA 为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA 互补链。因为DNA 聚合酶需要有一小段双链DNA 来启动("引导") 新链的合成，所以，新合成的DNA 链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA 链两端的退火决定的。

即首先将含有待扩增DNA 样品的反应混合物放置在高温(约94℃) 环境下加热1min ，使双链DNA 变性，形成单链模板DNA ；然后降低反应温度(约56℃) 制冷1min ，使引物与两条单链模板DNA 发生退火作用并结合在靶DNA 区段两端的互

补序列位置上；最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA 聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→ 3’方向延伸，合成新生DNA 互补链。以上循环在同一个PCR 管中进行。反应物加完后，温度由PCR 仪调整，程序完成后可以拿到产物。

多聚酶链式反应，即PCR 技术

是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复热循环构成，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA 片段扩增数百万倍。

原理：

高温变性：高温下，待扩增的靶DNA 双链受热变性成为两条单链DNA 模板； 低温退火：低温情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA 模板结合，形成部分双链；

适温延伸：在Taq 酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，Mg 2+存在下，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA 新链。

1、DNA 模板：反应中DNA 量在50ng ～200ng 左右。且DNA 纯度较高，以增加反应特异性。

2、dNTP:反应体系中达100μM ～200μM 。

3、Mg 2+：Mg 2+是Taq 酶的辅基，浓度在2.0mM 左右，浓度太低

Taq 酶活力降低；太高反应特异性降低。

4、引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基

左右；G+C含量在40％－70％之间；引物内部不能有回文序列；引物３’端不能互补。

5、Taq 酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在95℃时30分钟仍有50％活力。

器材：

1、台式高速离心机； 2、恒温水浴锅；3、PCR 扩增仪；4、琼脂糖凝胶电泳系统；

5、凝胶成像系统；6、Eppendorf 离心管； 7、PCR 小管。

试剂：

1、引物1、引物2； 2、dNTP mix；3、10×PCR Buffer；4、Taq DNA 聚合酶；

5、上样缓冲液；6、EB ；7、分子marker ；8、琼脂糖；9、TBE 缓冲液。 步骤：

1、加样

依次在PCR 小管中加入下列试剂（50ul 体系）：

10×PCR Buffer 5ul

dNTP mix 4ul

引物1 2ul

引物2 2ul

模板 3ul

Taq DNA 聚合酶 1ul

加水到总体积50ul

2、按以下参数进行PCR 扩增（对于不同的PCR 反应应设置不同的反应条件） 94℃ 预变性 4分钟

94℃ 变 性 30秒

51℃ 退 火 30秒

72℃ 延 伸 30秒

30 cycle

72℃ 延 伸 5分钟

4℃ 保 温

3、扩增结束后，取5ul 产物进行琼脂糖凝胶电泳以观察结果

半定量RT-PCR 原理：

半定量RT-PCR 是指通过总RNA 逆转录为cDNA 后，扩增目标cDNA 和内参cDNA ，通过PCR 产物量推测样品中特异mRNA 的相对数量。内参是基因组中保守的DNA 序列，其表达恒定，因此在总RNA 中所占的比例是大致恒定的。目标基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：β-actin （β肌动蛋白），GAPDH （三磷酸甘油醛脱氢酶）等 步骤： 1. 抽提RNA ，2. 反转录获得cDNA ，3. 以cDNA 为模板做PCR

注意： 步骤1，RNA 抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有βactin和GAPDH 两种。步骤3，半定量RT-PCR 应该在两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！

TaqMan 探针法

TaqMan 探针法是高度特异的定量PCR 技术，其核心是利用Taq 酶的5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan 探针法的定量PCR 反应体系中，包括一对PCR 引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报

告基团(Reporter, R) ，如FAM 、VIC 等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) ，如TAMRA 等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR 的进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA 的拷贝数。

TaqMan 探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan 探针和TaqMan MGB 探针。MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher) ，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder) 修饰基团（图5），可以将探针的Tm 值提高10°C 左右。因此为了获得同样的Tm 值，MGB 探针可以比普通TaqMan 探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA 碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 SYBR Green I荧光染料技术

SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA 双链结合的荧光染料。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量。SYBR Green 荧光染料法定量PCR 的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA 双链结合时发出荧光。2、DNA 变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR 产物。4、聚合完成后，SYBR

Green 染料与双链产物结合，定量PCR 系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA 双链相结合，对DNA 模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan 探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR 引物设计的特异性和PCR 反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

分子信标：

经典分子信标结构包括：

1、环状区（长度15～30个碱基的序列，能与目标分子特异结合）；

2、信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构）； 3、5’端荧光基团（徳克萨斯红、荧光素等染料）；

4、3’端猝灭基团（DABCYL ）。

工作原理：

无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生FRET ，荧光猝灭，荧光背景极低。

加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET 的发生，荧光恢复。 影响因素：

• 荧光—猝灭基团间的距离的影响：

E ：FRET 效率

R ：荧光给体与受体之间的距离

• 环境pH 值的影响：pH 过高时，茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基团与猝灭基团分开产生荧光。

分子信标的设计原理：

1、序列长度（环状序列比茎杆序列长两倍以上，茎杆序列不能过长或过短）

2、茎杆序列中G 和C 的含量不能太高

3、5’-端的第一个碱基最好不要选择G

4、由于被测对象DNA 或RNA 是大分子，存在扭曲现象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容易接近的那段序列来设计信标。

常用荧光剂与猝灭剂：

荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的效率与荧光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为了荧光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭基团激发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有：

1、EDANS （5′- (2′-氨乙基氨基奈-1-磺酸) 和DABCYL （4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯) ；

2、苯甲酸6-荧光素和DABCYL ；

3、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸 、香豆素和乙锭

荧光素和伊红 、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。

波长转移分子信标：

优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这些特征波长的荧光强度， 实现在同一体系中的多基因分析。

分子信标的应用：

• 核酸的检测分析

1. 实时定量PCR 测定靶标浓度

2. 活体内核酸的动态检测

3. 同时检测多个靶核苷酸

4. 检测双链DNA

• 研究DNA —蛋白质的相互作用 用于核酸酶的研究

用于研究DNA ——蛋白质的相互作用 • 用作生物芯片和生物传感器