牛血清实验报告

制药工程科研论文

江南大学

牛血清白蛋白的分离纯化及鉴定

学员：魏利莎 吴素平 孙锦

刘倩茹 胡健康 胡昭

指导教师：程建青

2013年9月14日

牛血清白蛋白的分离纯化及鉴定实验报告

作者：吴素平 魏利莎 孙锦 刘倩茹 胡健康 胡昭

（江南大学制药工程1003班）

摘 要：清蛋白，又称白蛋白（albumin,Alb）。由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19

天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%。溶于水且遇热凝固的一种球形单纯蛋白。是一类不被50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。存在于动物组织、体液和某些植物的种子中。其分子量较低，溶于水，易结晶。在中性溶液中加热即沉淀或凝固。其重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麦清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。人血清（或血浆）清蛋白占血清蛋白质的55～63％，是血清中少数不含糖的蛋白质之一；分子量67500道尔顿，有584个氨基酸残基和高净电荷（等电点4.9）；与水、Ca2+、Na+、K+、脂肪酸及胆红素都有较好的结合能力。 最熟知的球蛋白是人血清球蛋白，可经电泳法分成α1-、α2-、β1-、β2-和γ-球蛋白，有免疫性。此外还有乳球蛋白、肌球蛋白等。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。可分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白。在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。本实验利用白蛋白带负电的性质对其采用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离提纯牛血清白蛋白。

关键字：白蛋白； 人血清白蛋白； SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

一、牛血清白蛋白的分离纯化

【实验目的】

掌握牛血清白蛋白分离纯化各步骤（分段盐析、离子交换层析）原理及操作方法。

【实验原理】

盐析法是一种利用蛋白质在不同浓度盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将盐类加入到蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。

DEAE-纤维素是一种应用广泛的阴离子交换剂，它本身带有正电荷，能不同程度地吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同强度或不同PH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。

【实验器材】

1.主要仪器 离心机、透析袋、磁力搅拌器、自动核酸蛋白质分离层析系统、分光光度计、水浴锅。

2.主要试剂 （1）小牛血清。

（2）饱和硫酸铵溶液：称取767g固体硫酸铵，加入1000ml水中，加热使之溶解。室温冷却后4℃静置过夜，然后用氨水将PH调至中性。

（3）固体硫酸铵。 （4）聚乙二醇20000. （5）DEAE-纤维素。

（6）双缩尿试剂：用适量蒸馏水分别溶解1.6克硫酸铜及6克酒石酸钾钠，移入1L容量瓶中。加10％NaOH300ml后，再加蒸馏水定容至1L及得。此溶液久藏不坏，但如果出现暗红色沉淀，则不能使用。

（7）0.05mol/L pH6.4PBS。 (8)0.12mol/L pH6.4PBS。

【实验方法】

1.硫酸铵分段盐析

（1）量取20ml血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入饱和硫酸胺溶液20ml，边加边搅拌。放入4℃冰箱30分钟。

（2）从冰箱中取出烧杯，将血清倒入一离心管，3000rpm离心20分钟。

（3）将上清液倒入一干净量筒中，记录体积，倾入另一干净烧杯中，按17.6g/100ml的量称取固体硫酸铵，缓慢加入上清液中，边加边搅拌，4℃冰箱30分钟。

（4）3000rpm离心20分钟，沉淀用4ml 0.05mol/L pH6.4PB溶解。 （5）将上述液体对0.05mol/L pH6.4PB透析，过夜。

（6）用聚乙二醇20000浓缩至2-3ml。此蛋白粗提液留待层析。 2.DEAE-纤维素离子交换层析

（1）凝胶柱准备：连接自动核酸蛋白分离层析系统。夹住层析柱出口，加入1/3体积的0.05mol/L pH6.4PB，灌入层析剂，待层析剂自然沉降约2cm时，打开出口。层析柱填装完成后，盖好盖，调节适当流速，平衡过夜，等待加样。

（2）加样用吸管吸去胶面以上的缓冲液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁缓慢加入）。

（3）洗脱：打开出口，待蛋白粗提液完全进入胶内后，用少量0.05mol/L pH6.4PB清洗管壁。用吸管补足层析柱胶面以上的缓冲液，用0.05mol/L pH6.4PB洗去2个层析柱体积，再换用0.12mol/L pH6.4PB洗脱并分部收集洗脱液。

（4）检测：用双缩尿试剂检测洗脱液。有蛋白质的收集管出现紫红色，分别为第一蛋白峰和第二蛋白峰。收集第二蛋白峰处的各管，4℃冰箱保存，标记为DEAE样品。

（5）回收层析剂。

【注意事项】

1.盐析所用器皿一定要干燥。

2.盐析时，应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中，且缓慢地边加边搅拌。 3.层析柱上方要留有少量液体，避免使层析剂暴露于空气中。 4.上样前，层析柱要达到平衡。

5.上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面。 6.整个层析过程要控制好流速。

【实验结果】

从图上可以看出，本组实验的白蛋白含量还是很高的。但由于时间调节等原因，使得第二组峰比较平缓，没有集中于一点，若第二组峰也如第一组峰一样陡峭，实验会更加完美。

【思考与讨论】

1.本次实验最大的败笔就是在最后透析时，由于装液之前没有检查透析袋有没有固定好，最后样品全漏了。最后老师帮我们又做了一份，在这里要特别感谢程老师。通过此次实验，我深刻的意识到，在做实验过程中一定要细心，用心，耐心，不能再犯这种由于仪器没处理好而引发的低级错误了。

2.第二个做的不好的地方是，上课不认真听老师讲课，听了也不上心。在电脑作图时，中间应该关掉重启软件一次，将前面的杂质峰和后面的白蛋白峰分开。通过此次年实验，我们深刻的意识到，上课一定要认真听老师讲课，因为老师不会讲废话，既然讲了，就一定是实验要注意的重点和细节。所以，以此为鉴，下次认真听讲吧。

二、蛋白含量测定（双缩尿法）

【实验目的】

熟悉常用蛋白质含量测定方法（双缩尿法）及应用。

【实验原理】

凡具有两个以上肽键（—CO—NH—）的物质，在碱性溶液中与铜离子反应，形成紫红色络合物，称双缩尿反应。由于蛋白质含有肽键，故也能发生双缩尿反应。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

【实验器材】

1.主要仪器 分光光度计、水浴锅。

2.主要试剂 （1）蛋白样品。

（2）标准牛血清白蛋白溶液（4%）。 （3）0.9% NaCl。 （4）双缩尿试剂。

【实验方法】

1.取3支干净的试管按下表操作：

2.混匀，37℃水浴30分钟后以第三管调零，520nm波长比色，读取吸光度。 3.计算：

蛋白质含量g%=(测定管A520/标准管A520）×标准蛋白浓度

【注意事项】

1.若反应液的吸光度超出分光光度计的测量范围，则应将蛋白样品稀释一定倍数后再测定。【实验数据记录】

【实验结果】

取9、10、22、23号试管进行计算，得结果如下： 【实验思考与讨论】

本次试验犯的错误真是让人无语，吸光度测出来竟然有负值。原因是什么呢？竟然是做对照实验的比色杯没有擦干净，甚至能看到指纹，导致后来测出的一系列数据的不准。通过此次实验，我明白，做实验一定不能慌，不能急，哪怕别人都走了，我也要坚持做好自己要做的。做实验年一定要细心，注意细节。

三、牛血清白蛋白的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

【实验目的】

熟悉用SDS—聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对蛋白质纯度的鉴定。

【实验原理】

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向阳级或阴极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳。在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷的十二烷基硫酸钠（SDS)，可使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，据此，蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒的大小有关。

【实验器材】

1.主要仪器 电泳仪、电泳槽、电炉、脱色用摇床。 2.主要试剂

（1）5×SDS—PAGE电极缓冲液：电泳时稀释5倍。0.125nol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，1.25mol/L

甘氨酸，0.5%（W/V)十二烷基硫酸钠（SDS)。称15.1g Tris,94g甘氨酸，5gSDS，用蒸馏水定容至1000ml。

（2）分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris—HCl，pH8.8。称取18.17g Tris,80ml蒸馏水溶解，用HCl调pH8.8，蒸馏水定容至100ml。

（3）浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris—HCl，pH6.8。称取6.05g Tris,40ml蒸馏水溶解，用HCl调pH6.8，蒸馏水定容至50ml。

（4）30%胶贮存液：丙烯酰胺（Acr):甲叉双丙烯酰胺（Bis)=29:1 Pre-mixed Powder 9g,加蒸馏水溶解至30ml。若有沉淀需过滤。

（5）10%SDS。用时要加热溶解。 （6）10%过硫酸铵。临用前配。 （7）TEMED。

（8）2×样品溶解液：2×SDS—PAGE Loading Buffer。0.1mol/L Tris—HCl(pH6.8)，4%（W/V)SDS,0.2%(W/V)溴酚蓝，20%（V/V)甘油，2%（W/V)β-巯基乙醇。1.0mol/L Tris—HCl(pH6.8)1ml,SDS0.4g,溴酚蓝0.02g,甘油2ml,加蒸馏水溶解至9.8ml。分装成10个Eppendorf管（0.98ml/EP)，室温放置。用前加β-巯基乙醇0.02ml/EP。

（9）染色液：0.1%（W/V)考马斯亮蓝R-250,25%(V/V)异丙醇，10%（V/V)醋酸。称0.3g考马斯亮蓝R-250，加75ml异丙醇，30ml冰醋酸，用蒸馏水定容至300ml。若有沉淀需过滤。

（10）脱色液：10%（V/V)醋酸，5%（V/V)乙醇。取100ml冰醋酸，50ml乙醇，用蒸馏水定容至100ml。

【实验方法】

1.配胶（分离胶，浓缩胶），如下表：

2.封板，组装电泳槽。

3.灌入分离胶，缓慢加入1-2mm高度蒸馏水，使重叠于胶面上。待分离胶凝固后，倒出胶面上层的

水，剩余的水用滤纸吸干。

4.灌入浓缩胶，插入梳子。浓缩胶凝固后，拔出梳子。

5.样品处理：将分离纯化过程中留取的蛋白样品，稀释到含蛋白质2mg/ml，再按稀释液：样品溶解液=1：1的比例加入样品溶解液，煮沸5分钟，冷却后加样。

6.在梳子孔中加入处理好的样品20μl。连接好电极线，使负极上，正极下。稳压100V,电泳2-3小时。

7.电泳结束，取下胶，刮掉浓缩胶，染色液中染色30分钟。 8.用脱色液脱色24小时。

【注意事项】

1.30%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护。 2.过硫酸铵需现用现配。

3.过硫酸铵和TEMED加入后应立即灌胶。 4.用微量加样器加样时，勿刺破胶面。

【实验结果】

97．66．2KD

42．

14．4KD

从左到右加的样品依次是：mark试剂， ，9号样品，10号样品，22号样品，23号样品，粗蛋白样品，小牛血清白蛋白样品。由图看，本实验做的还不错，杂质不是很多。

【实验思考与讨论】

1.本次实验没出现操作问题，就是在前期配分离胶和浓缩胶的时候，操作不熟练。 2.加样时不熟练，加的很慢，加的位置不是很好，电泳时跑出的胶不是很直。

致谢：

感谢程建青老师的指导。

参考文献：

金坚、许正宏、邱丽颖等编写的《制药工程实验教程》 网络搜索：http://baike.baidu.com/view/42541.htm