高速逆流色谱操作
高效逆流色谱方法整理
分离苯酚与间苯二酚(254nm)
1、配溶剂:正己烷:乙酸乙酯:无水乙醇 :超纯水=1:1:1.2:0.8(均为分析纯) 所有试剂都扩大400倍体积,分液漏斗:先加水、乙酸乙酯、正己烷、无水乙醇混匀,放气,静置,分层,针对本实验,上层作固定相,下层作流动相(水+乙醇作为下相)中间部分丢弃。用瓶子装好后超声脱气5~10min,不宜过长时间。
原理:萃取每1S 17次,分配系数K=0.5~2之间为宜。
2、预热检测器30min以上(时长7-4h),选好波长(6个,215~405nm),采集时间应尽量长,流动相应尽量多配。(压力max=2MPa、R=1000转、流速max=40mL/min、进样量=30~300mg,max=500mg)
样品预处理:只能用分离系统中的溶剂,一般用流动相溶)
3、泵满上相,作固定相
泵入固定相,白色接D打开,一端放入量筒中,调流速30~40mL/min,再按泵的power,再按run,当固定相流到白色接D处即泵满。再按stop,上相不流入转轴部分。
4、平衡(40~50min)
白色D接好,泵放入流动相,废液管放入量筒。调所需波长、吸光值、流速。(流速不高于3mL/min,一般1.5-2之间,否则固定相被冲出去。)
先开转轴部分的power,调转速为900转再按泵的run,看废液的分层or吸光度变化or基线的平衡来判断是否已达到平衡。
总体积=285mL柱体积+20mL进样器+10mL柱外=315mL
固定相保留率=总体积-固定相流出的量 100%(一般40%~50%即可)柱体积(285mL)
5、进样
手动调节吸光度为0,按Load,再用针推进去气泡,进样管放入样品中,再用针拉以便进样。再按inject,再按电脑图谱中的绿色图标,即可记录图谱。测定完全后,再按红色按钮。
测定时有气泡:表示压力上升,解决用夹子夹住管,用反压阻止气泡进入分离系统(压力会上升,但不宜大于0.3~0.5 Mpa)
定量分析:>20mL即可,用30mL定容样品,全注入,进样圈容量为20mL,另外剩下的样品用针拉出,丢弃。(样品浓度要已知)
若仍有物质残留,则将原本FWD(正相、正接正转)换成REV(反相、正相反转)即可。操作:先按泵stop,转轴完全停止后,先将泵放到相反相中在按REV。
6、关机(先关检测器、仍inject状态)
(1)N2吹净:为防流动相流出,先关泵stop,再关转子的power。把泵从流动相中拿出,调流速40~30mL/min,再按泵的run,液体流到白色接D时,再按stop,白色接D拧开,开N2瓶,接D无花一端接到N2瓶的输出管中,废液流出。(气压不宜超过0.3Mpa,一般为0.1~0.2Mpa)关N2瓶。接回白色接D。
(2)95%乙醇or无水乙醇洗管
泵放入约100~150mL乙醇中,废液瓶不变,按run,流速40mL/min(约3~5min)后再按stop按钮。
(3)N2吹干
白色接D再拧开,泵拿出,接D无花一端接N2瓶,开N2瓶,干为手感无蒸气状即可(约30min)。
紫外:TP 540nm 黄酮 420nm 茶色素 380/460nm
aa 570nm Caf 274nm 可溶糖 620nm