本科毕业论文-大青叶多糖提取工艺研究

东北农业大学学士学位论文 学号：A06090014

大青叶多糖提取工艺研究

Study on Extraction Process of

Polysaccharide fromFolium Isatidis

学生姓名：

指导教师：

所在学院：动物医学学院

所学专业：动物药学

研究方向：中兽药学

东 北 农 业 大 学

中国·哈尔滨

2013年5月

摘要

大青叶为十字花科植物菘蓝的干燥叶，为我国大宗使用药材，其制剂生产销售堪称中药之最，是清热解毒药的代表。本文以大青叶为实验材料，采用传统水提醇沉的方法提取大青叶多糖。选取提取时间、提取温度、提取次数和液料比四个因素，进行正交试验设计。利用重量法测定大青叶粗多糖的得率。以粗糖得率为指标优选工艺。最佳工艺为提取温度85 ℃、提取时间1.0h 、提取次数2次、液料比25:1。本研究可为工业化生产和开发新的中兽药药源提供理论依据。

关键词：大青叶多糖；提取；正交试验

I

Study on Extraction Process of

Polysaccharide from Folium Isatidis

Abstract

Isatis indigotica Fort.(IIF) is a two-year-old cruciferous vegetable. Its root, leave and stem are named Radix Isatis (RI)and Folium Isatis (FI), respectively. They are the common traditional Chinese medicine with similar efficacy and representative medicines used for relieving heat and toxic. The extraction process of polysaccharides from residues targets for raw polysaccharide, which under conditions that adding 1% complex enzymes into materials and extracting for twice and 0.5 hours per time at temperature of 80℃。The extraction process which targets for fine polysaccharide is under conditions that 25:1(V/M) and extracting for twice and 1.0 hours per time at temperature of 85℃。This research can provide a theoretical basis for utilization and process improvement of FI.

Key words: Folium polysaccharide ; extract ; Orthogonal design

II

目 录

摘要 . .................................................................................................................................................. I Abstract ............................................................................................................................................ II 目录 . ................................................................................................................................................ I II 1 前言 . ......................................................................................................................................... - 1 -

1.1 大青叶研究概况 . .............................................................................................................. - 1 -

1.1.1来源及其药材性状 ..................................................................................................... - 1 -

1.1.2在兽医临床上的应用 .................................................................... 错误！未定义书签。

1.2大青叶的研究现状 . ........................................................................................................... - 1 -

1.2.1化学成分研究 . ............................................................................................................ - 1 -

1.2.2药理作用研究 . ............................................................................................................ - 1 -

1.3多糖的提取方法 . ............................................................................................................... - 2 -

1.3.1溶剂提取法 . ................................................................................................................ - 3 -

1.3.2稀酸提取 . .................................................................................................................... - 3 -

1.3.3碱提取 . ........................................................................................................................ - 3 -

1.3.4酶提法 . ........................................................................................................................ - 3 -

1.3.5超滤法 . ........................................................................................................................ - 3 -

1.3.6微波提取法 . ................................................................................................................ - 3 -

1.4本课题的研究意义 ........................................................................................................ - 3 - 2正交试验优选大青叶多糖的提取工艺 ...................................................... 错误！未定义书签。

2.1材料与方法 . ....................................................................................................................... - 4 -

2.1.1实验材料 . .................................................................................................................... - 4 -

2.1.2实验仪器 . .................................................................................................................... - 4 -

2.2大青叶多糖提取 . ............................................................................................................... - 4 -

2.3 各因素对多糖得率的影响 .................................................................. 错误！未定义书签。

2.3.1液料比对大青叶多糖得率的影响 ............................................ 错误！未定义书签。

2.3.2 提取时间对大青叶多糖得率的影响 ....................................... 错误！未定义书签。

2.3.3 提取温度对大青叶多糖得率的影响 ....................................... 错误！未定义书签。

2.3.4 提取次数对大青叶多糖得率的影响 ....................................... 错误！未定义书签。

2.4 数据处理方法 . ..................................................................................... 错误！未定义书签。

2.5 正交试验优选大青叶中大青叶多糖水煮醇沉工艺研究 ............................................... - 5 - 3结果与分析 . ................................................................................................. 错误！未定义书签。

3.1 单因素对大青叶粗多糖的影响 ....................................................................................... - 7 -

3.2 正交试验设计对大青叶精多糖提取工艺研究结果 .......................... 错误！未定义书签。 4讨论 . ........................................................................................................................................ - 10 - 5结论 . ............................................................................................................. 错误！未定义书签。 参考文献 . ................................................................................................................................... - 11 - 致 谢 . ....................................................................................................................................... - 13 - III

1 前言

1.1 大青叶研究概况

1.1.1来源及其药材性状

大青叶的来源颇多, 全国各地有大青叶及其混淆品、代用品达6科15种之多，这么多的同名异物品当作大青叶使用，其形成有着历史的原因。《中国药典》自1985版起明确规定十

[1]字花科植物菘蓝的叶为大青叶正品。干燥叶皱编成团块状，有时破碎，呈灰绿色或黄棕色。

完整的叶呈长椭圆形至长圆状倒披针形，长4～11厘米，宽1～3厘米，全缘或微波状；先端钝尖，基部渐狭，延成翼状，上面有时可见点状突起，下面中脉明显。叶柄长5～7厘米，腹面稍凹下。质脆易碎。气微弱，味稍苦。以叶大、无柄、色暗灰绿者为佳。

1.2大青叶的研究现状

1.2.1化学成分研究

近年来，对大青叶化学成分的文献报道主要集中在生物碱、有机酸、苷类、甾醇等几大类化合物上。

吲哚类生物碱：靛蓝、靛玉红、大青苷B （有的也称大黄素B 和靛红烷B ）、异靛蓝。药典2005版以靛玉红作为大青叶药材的质量控制标准。靛玉红及其同系物能够抑制细胞周期蛋白依赖激酶，因而对慢性粒细胞白血病具有明显的抑制作用。此外，靛玉红还可以刺激感染流感病毒的支气管上皮细胞中T 细胞的表达和分泌，具有一定的免疫调节作用[3]。 喹唑酮类生物碱：青黛酮、4-（3H ）-喹唑酮、2,4-（1H,3H ）-喹唑二酮、色氨酮[4]。

有机酸类：丁香酸、水杨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、棕榈酸、烟酸、琥珀酸[5]。 苷类：芸苔葡萄糖硫苷、新芸苔葡萄糖苷[6]、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷[7]。 无机元素：锌、铁、钙、镁、锰、铜、钾、钠等无机元素[8]。

多糖类：大量研究表明植物多糖是一种良好的免疫调节剂，广泛存在于自然界。大青叶多糖是大青叶中含量较多的、免疫活性较强的一类物质[9]。

其他：大青叶中还含有10H-indolo-(3,2-b)-quinoline[6]、deoxyvascinone [6]、落叶松脂素[6]、多种氨基酸[10]、挥发性成分[10]。

1.2.2药理作用研究

大青叶具有多种化学成分和药理作用，其不同的活性成分、化学成分的生物活性不同，或药效作用程度不一，即使同样的化学成分也表现出不同的药理活性，由此可见，大青叶可能是由多种化学成分，通过多种途径、多个靶点作用于机体来发挥药效的。

抗菌作用：大青叶有抗病原微生物的作用。郑剑玲等[11]采用试管稀释法测定大青叶的各级提取物(水提液、乙醇提取液、正丁醇萃取液) 对金黄色葡萄球菌、肠炎杆菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)，实验证明各级提取物对实验菌分别有不同程度的抑菌作用．其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最为明显。张连同[12]用K —B 纸片扩散法测定大青叶的水煎剂的体外抑菌活性，发现大青叶在体外对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌均有明显抑菌作用。孙立新[13]等则以枯草杆菌和短小芽胞杆菌作为大青叶的药理活性检测指标。说明大青叶类药材具有广谱的抑菌作用。

抗病毒作用：采用大青叶注射液做抗病毒试验，证明其对甲型流感病毒、乙型脑炎病毒、

[14][15]腮腺炎病毒、流感病毒有抑制感染并有抑制增殖作用。刘盛等选用鸡胚法考察不同性

质的大青叶对甲型流感病毒(A1京防86—1) 的抑制作用。其血凝滴度实验结果表明大多数药材对甲型流感病毒有直接作用、治疗作用和预防作用。王学兵[16]等通过观察PK-15细胞病变效应（CPE ）来评价大青叶多糖的不同加药方式体外对猪细小病毒（PPV ）的阻断和抑制 - 1 -

作用，结果表明大青叶多糖在对细胞的安全浓度范围内，对猪细小病毒有明显的阻断作用和抑制作用。

抗内毒素活性：大青叶性味苦寒，具清热解毒凉血利咽的功效。现代医学关于清热解毒功效的阐释目前主要集中于以下两点：一是抗细菌内毒素作用；二是抗病原微生物作用，尤其是抗内毒素活性为该类中药的重要特征[14]。刘云海等[17]采用动态浊度法测定细菌内毒素浓度，观察大青叶不同化学部位对放线菌素D 敏化小鼠内毒素致死攻击的保护作用，并以内毒素制备家兔发热模型，测定其肛温变化，实验发现大青叶的正丁醇萃取部位能直接中和降解内毒素，显著降低内素的致热性和致死性，说明其具有显著的体内、外抗内毒素活性。 对免疫系统的作用：大青叶用来治疗各种感染性疾病由来已久。为了解其在免疫调节中的作用，张淑杰等[18]观察了大青叶水煎剂对小鼠免疫细胞功能的影响。结果试验发现：大青叶水煎剂对小鼠脾淋巴细胞的增殖反应具有上调作用，同时大青叶与刀豆素A （ConA ）和细菌脂多糖（LPS ）协同对小鼠脾淋巴细胞增殖活性有促进作用，并且能促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，推断大青叶的抗炎、抗病毒作用可能不是直接抑菌、杀菌，而在于调动机体内的其他抗感染功能[18]。赵红等[19]通过3H —TdR 掺入法测定不同深度大青叶水煎剂对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的毒性作用，用MTT 方法TNF 的敏感细胞株L929．白细胞介素IL-2的依赖株(CTLL-2)分别检测IL-2、TNF 的生物学活性。结果表明大青叶水煎剂在0.4～1.6mg/ml时，能促进正常小鼠被ConA 诱导的脾淋巴细胞分泌IL-2，但对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-a 无明显作用．认为大青叶水煎剂通过促进淋巴细胞IL-2的分泌可以上调小鼠免疫功能，同时对巨噬细胞分泌 TNF 致炎效应和免疫病理损伤无明显影响。

国外学者实验证明蓼大青具有很好的抗过敏活性，它能够抑制化合物48/80和抗二硝基苯IgE 抗体引起的肥大细胞的过敏性反应[20]。另有实验表明：蓼大青的醋酸乙酯萃取部分能够显著地抑制NO 的合成，其途径是通过小鼠腹膜的巨噬细胞诱导干扰素-γ脂多糖，且这种抑制作用随药物的增加而增大，该研究结果表明蓼大青的萃取物可能对涉及NO 合成的多种疾病具有潜在的治疗和调节作用[21]。由于大青叶及其代用品具有抗炎作用，人们针对其有效化学成分靛玉红进行了研究，发现靛玉红不仅可以通过HBL-38抑制干扰素-γ的生成，还可以由脾细胞抑制干扰素-γ和白细胞介素的产生[22]。大青叶中的另一化学成分色胺酮具有改善由右旋糖苷硫酸钠诱发的大肠炎症的功能。给小鼠饮用5％的右旋糖苷硫酸钠水诱发产生大肠炎症，同时每日给小鼠po100mg∕kg色胺酮，组织病理学分析结果显示6d 后观察到服用色胺酮组的大肠的损伤程度较小，而一旦停止用药，损伤则重新产生；体外实验表明服用色胺酮的小鼠脾细胞产生的白细胞介素IL-2和干扰素-γ的量较少；实验中服用色胺酮组的小鼠全部灭活，从而证明色胺酮对肠炎具有治疗作用[23]。

抗癌作用：大青叶具有具有抗肿瘤作用，大青叶中的靛玉红对动物移殖性肿瘤有较强的抑制作用，对慢性粒细胞白血病有较好的疗效。最近人们运用新近发展的药理模型证明靛玉红可能是芳香基型内源配体，可以被外源配体激活，调节多种酶系统以及参与细胞增殖的调节。研究表明靛玉红很可能通过诱导MCF-7肺癌细胞中细胞色素P4501A1和1BlmRNA 酶的活性，参与调节肺癌细胞的新陈代谢[24]。另外，赵从凯等用大青叶多糖对小鼠S180肉瘤进行作用研究后发现，大青叶多糖的浓度越高，其抑瘤率越高，说明大青叶多糖在抗癌方面有一定作用。

1.3多糖的提取方法

种类繁多的植物多糖，存在于植物中的不围不尽相同。一般植物细胞壁比较牢固，在提取前需要进行专门的破细胞操作，包括机械破碎法、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解。因此，植物多糖提取的研究中采用了许多不同的方法，包括溶剂提取、酸提法、碱提法、酶提法、超滤法、微波法等。

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