切胶回收注意事项

胶回收DNA注意事项

胶回收DNA注意事项

①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。

②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。

③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。

⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH值，以增加洗脱得率。

⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。

⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。

⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。

⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

关于胶回收切胶的一点注意事项

1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。

2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以

用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。

3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。

4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。

胶回收

一. 提高胶回收量的办法：

1) 增加电泳时的上样量。

2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。

4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。

6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。

最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以

上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。

四、一些注意事项

1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。

2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。

3.关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果你戴树脂眼镜就可以了。

4.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。

5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。

6.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。

7.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。

附注：

1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）

2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA

Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb

1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.

3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm

5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃

6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)

7)电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢

DH5α

DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，普通的大肠杆菌细胞内有一种“免疫”机制，即当外源DNA 侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰（如甲基化）所以不被限制酶识别，不会被剪切。这样的菌是不能直接用于基因工程的，我们总不希望目的基因导入进去还来不及复制就被剪切掉。DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。Rˉ是指DH5α菌株缺乏DNA 修饰，即其自身DNA不会被修饰。Mˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。AMPˉ是指其对青霉素敏感。 DH5α菌株可以用于制作基因库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌。

2012-11-29日 中肠，脂肪体内参检测(rps3)，产物片段358bp