土壤微生物

鲍士旦.土壤农化分析(第三版)7M〕.北京:农业出版社.2000

一 微生物量测定

1 土壤最大田间持水量的测定

称取各处理新鲜土样100g,于105℃下烘干8h,测得干重为W1；用14cmX15cm底部有孔的花盆,盆底部铺一层滤纸,测得花盆和滤 纸的总重量为W2,每盆加入100g新鲜土样,每盆先加入一定量的水,

使土壤中的水分达到饱和状态,静止2h后,再等量加入水,如此重复数次,直到土壤表面无积水,且花盆底部不积水为止,这时称取相应花盆和土壤的总重量为W3,每处理设3个重复。根据下式计算100g新鲜

土壤最大田间持水量(中国土壤学会,1999)。

土壤最大田间持水量/100g=W3-W2-W1

2 土壤预处理

将供试土壤水分含量调至最大田间持水量的40%，然后将土壤置于直径X高=14cmx17cm塑料桶内，内放两个50mL小烧杯，一个盛30mL蒸馏水，另一个盛30mLI%NaOH溶液，以保持桶内的湿度和吸收释放的CO2，塑料薄膜密封，于25℃恒温培养室内黑暗条件下培养一周(中

国土壤学会，1999)。

3 土壤样品熏蒸

称取相当于25g烘干土重的湿土，放入100mL的小烧杯中，连同盛有5OmL左右无乙醇氯仿的小烧杯(里面放入少量碎瓷片，防止暴沸)，一起放入真空干燥器内，真空干燥器底部加入少量水和稀碱(lmolL/NaOH)。抽真空，使氯仿沸腾，并持续2min以上，关闭真空

干燥器的阀门，然后将真空干燥器放入25℃暗室中，保持24h。取出氯仿(倒回瓶中重复使用)，除尽干燥器底部的碱，再用真空泵反复抽气3-5次，每次3min以上，直到土壤闻不到氯仿味为止。(中国土壤学会，1999)。

称取等量的土壤,置于另一干燥器中为对照试验

4 土壤微生物碳的测定

采用灭菌---提取法。从干燥器中取出土样，放入15OmL三角瓶中，加入0.5mol/LK2SO4溶液(1：4土水比)，振荡30min(25℃，200r/min)

后迅速用中速滤纸过滤，滤液立即测定或在-15℃下保存。吸取10mL浸提液于15OmL消煮管(直径24mm，长295mm)，加入10mL0.018mol/LK2Cr2O7-H2SO4溶液(H2SO4浓度为12mol/L)，放入少量

石英沙，摇匀后置于175士1℃的磷酸浴中煮沸10min，冷却后将溶液转移到150mL的三角瓶中，使总体积约为80mL，加一滴邻啡罗琳指示剂，用0.05mol/L FeSO4溶液滴定至终点。(中国土壤学会，1999；

林启美等，1999)。

土样碳含量=(V样品消耗硫酸亚铁—V空白消耗硫酸亚铁)xC硫酸亚铁浓度X3X5/(鲜土重X土壤含水量)

土壤微生物碳(mg/kg)=Ec/kEC

Ec--熏蒸与未熏蒸土壤中有机碳的差值， KEC--氯仿熏蒸杀死的微生

物体中的碳被浸提出来的比例，取0.38。

5 土壤微生物氮的测定

采用Ross提出的方法(Ross，1992)。取20mL K2SO4提取液于开

氏消煮管中，加入5mL浓H2SO4，沸水浴中加热至溶液减少一半，冷

却，加入2g混合催化剂(K2SO4100：CaSO410：Se1)，在开氏消煮炉上

缓慢加热(150℃)约2h直至消煮管中的水分全部蒸发掉，然后高温(硫酸发烟)消煮约3h至消煮液完全澄清，再次冷却，将消煮管接到开氏定氮仪上同土壤全氮进行蒸馏，然后用0.0051mol/L标准酸(HCL)溶液滴定硼酸吸收液(中国土壤学会，1999)。

土样氮含量=(V样品消耗的盐酸-V空白消耗盐酸) xC 盐酸浓度X14X10/ (鲜土重x土壤含水量)

土壤微生物氮(mg/g)=EN/KEN

EN--熏蒸与未熏蒸土壤中所浸提的全氮的差值 (mg/kg)；KNE--氯仿熏蒸杀死的微生物体中的氮被浸提出来的比例，取0.45。

二 菌的分析：细菌、真菌、放线菌

土壤微生物培养法

准确称取待测样品10g，放入装有100ml无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置约20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液1ml移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，也尽量洗下粘在瓶壁上的菌落，减少误差，此即成10-2稀释液；再换

一支无菌吸管吸取10-2菌液1ml移入装有9ml无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度的菌液，供平板接种使用。对于土壤中不同类的微生物通常采用不同的稀释度，使每个平皿中的菌落数以30-300个菌落为宜：真菌为10-1- 10-5，放线菌为10-3-10-5，细菌为10-4-10-6，固氮菌为10-4-10-6。每个稀释度均做3次重复。 1 细菌的鉴定及数量的测定

在感量天平上用称量纸称取牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂15g。将牛肉膏、蛋白胨放在量杯中，加热至水沸腾时放入琼脂，待其完全熔化后，定容至1000ml，，调其pH值在7.0-7.2之间，并分装到三个500ml的三角瓶中，在103kPa的压力下灭菌20min。将灭菌后的培养基趁热倒平板。将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平皿中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平皿中，再吸取10-4稀释液各1ml，放入编号10-4的3个平皿中(由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换)。用玻璃刮刀将稀释液均匀涂抹在培养基表面。完成后，倒置培养皿，放入恒温箱中在30℃下培养48h。经培养适当时间后，取出平皿，计数平板上出现的菌落。稀释平板法的适宜测量范围是：细菌为每皿50-200个菌落。并按以下刮刀法的计算式计算：N=(c*t*10)/mxk，其中N为每克干土的菌落数，c为菌落的平均数，t为稀释倍数，m为土壤样品的质量(g)，k为水分系数，k=1-土壤含水量。计数结果采用浮点计数法。

2真菌的鉴定及数量的测定

用感量天平称取KH2PO4 1.0g，MgSO4.7H2O 0.59，葡萄糖10.0g，

琼脂15g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1000ml。在定容后的培养基中加入1%的孟加拉红水溶液3.3ml，不需调PH值，将培养基分装到三个500ml的三角瓶中，在103kPa的压力下灭菌20min。培养基灭菌后，每100ml需再加入1%的链霉素液(称取1g链霉素溶于100ml无菌水中)0.3ml。平板接种培养实验方法同细菌的操作，但真菌采用土壤悬液的稀释梯度为10-1，10-2，10-3。接种后在恒温箱中在30℃下培养72h。真菌的菌落计数实验操作同细菌的操作方法，但计数时挑选的平皿为每皿20-80个菌落。

3放线菌的鉴定及数量的测定

用天平称取KN03 1.0g，FeSO4.7H2O 0.01g，MgSO.7H20 0.5g，NaCI

0.5g，琼脂15g，淀粉20g，定容至1000ml。分装后在103kPa的压力下灭菌20min。培养基灭菌后，在熔化的培养基中加入重铬酸钾溶液，其数量为每300ml培养基加入1ml重铬酸钾，以抑制细菌和霉菌的生长。平板接种培养实验方法同细菌的操作，但放线菌采用土壤悬液的稀释梯度为10-3，10-4，10-5。接种后在恒温箱中在30℃下培养7d。放线菌的菌落计数实验操作同细菌的操作方法，但计数时挑选的平皿为每皿50-200个菌落。

三 土壤有机质

土壤有机质是评价土壤肥力的重要指标,也是环境分析测定的基

2真菌的鉴定及数量的测定

用感量天平称取KH2PO4 1.0g，MgSO4.7H2O 0.59，葡萄糖10.0g，

琼脂15g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1000ml。在定容后的培养基中加入1%的孟加拉红水溶液3.3ml，不需调PH值，将培养基分装到三个500ml的三角瓶中，在103kPa的压力下灭菌20min。培养基灭菌后，每100ml需再加入1%的链霉素液(称取1g链霉素溶于100ml无菌水中)0.3ml。平板接种培养实验方法同细菌的操作，但真菌采用土壤悬液的稀释梯度为10-1，10-2，10-3。接种后在恒温箱中在30℃下培养72h。真菌的菌落计数实验操作同细菌的操作方法，但计数时挑选的平皿为每皿20-80个菌落。

3放线菌的鉴定及数量的测定

用天平称取KN03 1.0g，FeSO4.7H2O 0.01g，MgSO.7H20 0.5g，NaCI

0.5g，琼脂15g，淀粉20g，定容至1000ml。分装后在103kPa的压力下灭菌20min。培养基灭菌后，在熔化的培养基中加入重铬酸钾溶液，其数量为每300ml培养基加入1ml重铬酸钾，以抑制细菌和霉菌的生长。平板接种培养实验方法同细菌的操作，但放线菌采用土壤悬液的稀释梯度为10-3，10-4，10-5。接种后在恒温箱中在30℃下培养7d。放线菌的菌落计数实验操作同细菌的操作方法，但计数时挑选的平皿为每皿50-200个菌落。

三 土壤有机质

土壤有机质是评价土壤肥力的重要指标,也是环境分析测定的基

本项目之一。本实验采用重铬酸钾容量法-砂浴热法测定土壤总有机质。基本原理:用过量重铬酸钾-硫酸溶液,在电砂浴加热条件下,氧化土壤有机碳,剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁标准溶液滴定。根据氧化前后氧化剂质量差值,计算有机碳量,并乘以系数1.724,即为土壤有机质含量。

操作步骤:土样风干,磨细,过0.25mm筛。重量法测含水率。称取0.2g土,置于150ml磨口锥形瓶中,加O.lg粉末状硫酸银(避光),再加10ml 0.4M重络酸钾硫酸溶液。摇勾。将盛有试样的锥形瓶-简易冷凝管,移至180°C的电砂浴上加热。当冷凝管落下第一滴冷凝液时开始计时,消煮8min。消煮完成后从砂浴上移下冷凝管,用水冲洗,使洗漆液流入原三角瓶,瓶内溶液总体积控制在30ml左右。冷却后加3滴邻菲罗啉指示剂。用硫酸亚铁标准溶液滴定剩余的重铬酸钾,滴定终点:蓝绿变砖红色。空白取0.2g粉末二氧化硅代替试样。硫酸亚铁标准溶液的浓度每次使用前需标定浓度。

四 土壤酶

张彬做了脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、过氧化氢酶，在结论部分这四种酶对土壤微生物的影响都不显著。有研究只选择氧化还原酶类中的过氧化氢酶和水解酶类中的庶糖酶。

具体的方法如下选自今年的毕业论文《气候变化背景下土壤微生物群落对干旱和大气CO2倍增的响应》

1 过氧化氧酶

过氧化氢酶的测定有测压法和滴定法。本研究采用滴定法。 基本原理:定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氧量。

操作步骤:取2.0g 土,置于150ml三角瓶中,并注入40ml蒸馏水和5ml0.3%的H2O2溶液,同时设置对照,即三角瓶中注入40mL蒸馏水和

5mL质量分数为0.3%的H2O2溶液而不加土样。塞紧瓶塞,置于120r/min

振荡20min后,加入5ml I.5M H2SO4终止反应,慢速滤纸过滤。吸取25ml

滤液,用0.1M高猛酸钾滴定至淡粉红色。对照试验为无土壤的试剂空白。注意0.1M KMn04的浓度需要每次标定,具体方法为称取0.2000g

草酸钠(105-110℃烘至恒重)。溶于100ml(8+92)硫酸溶液中,用配制好的高猛酸钾溶液滴定,近终点时加入至65,继续滴定至溶液呈粉红色保持30s。土壤过氧化氢酶活性以单位土重消耗0.1mol/LKMn04的体积(mL)来表示。

2 庶糖酶

蔗糖酶又称转化酶,它存在于所有土壤中,它能酶促庶糖分子中果糖残基内的β-葡萄糖苷碳原子处的健裂解,使庶糖水解成葡萄糖和果糖。土壤转化酶活性,与土壤中的腐殖质、水溶液有机质和粘粒的含量以及微生物的数量极其活动呈正相关。本实验釆用3,5 二硝基水杨酸比色法测定土壤中蔗糖酶含量。

基本原理:测定蔗糖酶水解时生成的还原己糖的量。

操作步骤:称取0.2g鲜土,置于50ml三角瓶中,注入15ml 8%的庶糖溶液,5ml pH5.5的磷酸缓冲液和0.25ml甲苯。摇勾后,于37°C恒温培养,24h后取出迅速过滤。从中吸取滤液1ml,注入50ml比色管中,

加3ml3,5 二硝基水杨酸,沸水水浴加热5min,自来水冷却3min。用蒸馈水稀释至50ml,分光光度计上于波长508mn处比色。

对照试验:无蔗糖对照;无土壤对照。

标准曲线:取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml比色管中,与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色。

仪器药品（上面涉及到的）

花盆 滤纸 直径X高=14cmx17cm塑料桶 烧杯 塑料薄膜 烧杯 Ph计 干燥器 三角瓶 消煮管 摇床 接种平板 天平 恒温箱 开氏定氮仪 开氏消煮炉 磨口锥形瓶

NaOH 氯仿 K2SO4 K2Cr2O7 石英沙 磷酸 邻啡罗琳指示剂 FeSO4 CaSO4 Se HCL 硼酸 牛肉膏 蛋白胨 琼脂 KH2PO4 MgSO4.7H2O 葡萄糖 庶糖 孟加拉红 链霉素 KN03 NaCI 淀粉 二氧化硅 粉末状硫酸银 硫酸 草酸钠 高猛酸钾 甲苯 3,5 二硝基水杨酸 H2O2 孟加拉红水溶液