PCR技术在微生物检测中的应用前景_曾勚

PCR 技术在微生物检测中的应用前景

曾　勚

（新会出入境检验检疫局，广东 江门　529100）

摘　要：随着时代的发展和科学技术的进步，PCR技术被广泛的应用于各个领域之中，这是因为PCR 技术具有一系列的优点，比如特异性较高、灵敏度较高等等[1]。 PCR的全称是聚合酶链式反应，它是一种体外扩增DNA 序列的技术。本文简要分析了PCR 技术的原理，然后阐述了PCR 技术在微生物检测中的应用前景，希望可以提供一些有价值的参考意见。

关键词：PCR 技术；微生物；检测

中图分类号：TS107 文献标志码：A 文章编号：1000-8772（2013）16-0203-02随着科学技术的不断革新，涌现出了各种各样的新技术，并且应用的领域也越来越广泛。生物指标检测手段方面也在不断的发展和进步。其中，DNA、蛋白质等物质作为了大部分分析研究的对象。PCR的全称是聚合酶链式反应，它是一种体外扩增DNA 序列的技术[2]。PCR技术因为具有一系列的优点，如快速准确、灵敏度较高等。目前，很多领域内已经开始应用这项技术，如医学检验、水产养殖、环境监测等领域。本文简要阐述了PCR 技术的原理，然后分析了PCR 技术在一次性使用卫生用品微生物检测的应用前景。

增DNA 序列的具体信息进行确定。

二、PCR技术在微生物检测中的应用前景

依据相关一次性使用卫生用品的微生物指标规定，我们可以了解到不能有大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌存在于一次性使用卫生用品中[4]。那么，要求就是定性检测这四种菌，规定采用的检测方法是微生物鉴定法。这种方法十分的传统，具体指的是首先通过增菌或分离培养，然后进行鉴定试验，依据的是各菌群特征，最后对各项结果进行综合判断和分析。如果采用传统的检测方法，往往会需要花费很长的时间，且如果菌量不大，很容易出现假阴性的结果；如果可以采用PCR 技术，检测就不需要花费过多的时间，并且有着更高的敏感性和准确性。

大肠杆菌的检测：根据相关的研究表明，通过大肠杆菌特异性引物进行PCR 扩增，可以将饮用水中的大肠杆菌给检测出来，这种检测并不会受到菌量大小的影响。该研究还发现，对于不能够破坏微生物DNA 的消毒方法会造成PCR 检测的假阳性，而在目前的相关规范中，主要将环氧乙烷消毒、电离辐射消毒以及压力蒸汽消毒等应用于一次性使用卫生用品中。通过实践研究发现，如果采用这些灭菌方法，会直接破坏微生物的核酸。因此，在检测一次性使用卫生用品致病菌中，

[5]

PCR 技术是可行的。

绿脓杆菌的检测：通过相关的试验研究表明，使用绿脓杆菌外霉素A 基因，也就是ETA 作为模板，来对绿脓杆菌进行快速的检测。只有绿脓杆菌基因组中存在着ETA 基因，并且相关的科学家已经从一个过量表达ETA 的绿脓杆菌菌株中对ETA 的结构基因进行了克隆和测定。因此，要想对绿脓杆菌进行检测，靶基因可以选取ETA 基因。依据ETA 基因序列设计特异性引物，通过PCR 反应来对目的基因序列进行扩增，如果能够扩增出目的条带，就可以依据此来对绿脓杆菌的存在进行确定。

金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的检测：通常情况下，在食品卫生领域内，通常采用PCR 技术来对金黄色葡萄球菌进行检测。我国的部分专家优化了PCR 的影响，将那些可能会对PCR 反应造成影响的抑制因素进行消除，这样检测方法的灵敏度就可以得到大幅度的提高[6]。在溶血性链球菌的检测方面，我们进行了一个试验，通过GAS （下转第205页）

一、PCR技术原理

PCR 的全称是聚合酶链式反应，它是一种体外扩增DNA 序列的技术。在上个世纪八十年代的时候，美国一位科学家最早提出了PCR 的概念，为此 1993年的诺贝尔化学奖颁发给了这位科学家。经过近些年的发展，PCR技术已经成为生物领域内十分重要的一项前沿技术。

简单来讲，PCR技术的基本原理和细胞内DNA 的复制过程十分的相似，其特异性主要依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通常情况下，可以将PCR 技术分为三个基本反应阶段，分别是变性、退火和延伸。具体来讲，它的基本过程是这样的，一是通过预处理检测样品，获得DNA 模板；二是DNA 模板的变性，加热DNA 模板，使其达到95摄氏度左右，这样可以使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离后成为单链，能有效地结合引物，从而促进后阶段的反应；三是模板DNA 与引物的退火，通过上文的叙述我们可以得知，经过加热之后，模板DNA 会成为单链，并且温度也开始下降，降低到55摄氏度左右，人工合成的引物与模板DNA 单链经互补序列配对结合[3]；四是引物的延伸，耐热DNA 聚合酶会对DNA 模板和引物结合物产生催化作用，反应原料是4种三磷酸脱氧核苷酸，模板采用的是靶序列，合成一条新链，它有着与模板DNA 相同的组成结构，依据的是碱基互补配对与半保留复制原则。要想获得更多的新链，只需要对变性、退火、延伸三个步骤进行重复的循环即可，而且下次循环的模板就是这次产生新链。通常情况下，只需要2分钟就可以完成一个循环，一般单一拷贝的基因循环25次左右，DNA就可以实现扩增100万倍，甚至是200万倍。依据凝胶电脉和基因测序等DNA 分析技术可以有效的对PCR 反应产物的扩

收稿日期：2013-05-21

作者简介：曾勚（1982-）女，广东江门人，本科，助理工程师。研究方向：微生物检测。

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三、结束语

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（责任编辑：王伟）

（上接第203页）特异的致热性外毒素B 基因特异性序列进行PCR 扩增；通过试验结果我们可以看出来，用PCR 技术检测GAS 快速、敏感，十分的可靠，具有可行性。

术的发展速度也会越来越快，并且逐渐的应用到更多的领域之中。本文简要分析了PCR 技术的原理，然后分析了PCR 技术在一次性使用卫生用品微生物检测中的应用前景，希望可以提供一些有价值的参考意见。

参考文献：

[1]常玉华，仇农学. 基于PCR 技术快速检测食品微生物的原理、方法与应用[J].农产品加工，2011，2（11）：123-125.

[2]方平.PCR 技术在食源性致病微生物快速检测中的应用[J].中国食品工业，2006，2（11）：124-136.[3]钟仕花，周娟，葛虹.PCR技术在沙门氏菌检测中的应用[J].黑龙江科技信息，2009，2（23）：45-47.

[4]王元平，吴清平，张菊梅. 芯片技术及其在食品卫生微生物检测中的应用[J].中国卫生检验杂志，2002，2（2）：145-146.

[5]赵改名，王允祥，郭新海.PCR 技术在食品微生物安全性检测中的应用[J].肉品卫生，2003，2（3）：167-169.[6]叶怀庄，吴丽丽.PCR 技术在卫生微生物检测中的应用[J].中国卫生检验杂志，1996，2（4）：143-145.

（责任编辑：时音菠）

三、PCR技术在应用过程中的一些注意事项

PCR 技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，且相较于传统的微生物检测法，PCR技术的检测时间也得到了大幅度的缩减。在卫生用品的检测中应用PCR 技术，需要注意这些问题。一是因为检测样品是卫生用品，那么在具体的操作过程中可能会遇到各种问题，比如预处理样品的过程中、提取样品DNA 的过程中等等，所以就需要具体问题具体分析。二是虽然PCR 反应有着十分简单的步骤，但是在具体的操作中，却存在着一定的难度，比如退火温度的适宜范围、如何确定延伸时间、循环数的确定等。不同的反应体系，应该给对反应条件进行适当的确定，避免出现一些假阴性或假阳性的情况。因此，在对卫生用品中的微生物进行检测时，应用的是PCR 技术，就需要进行预试验，对检测方法进行不断的完善。

四、结语

随着时代的发展，特别是科学技术的不断革新，PCR技