自来水中细菌总数的测定

自来水中细菌总数的测定

【摘 要】水也是微生物存在的天然环境，水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。目前我国规定生活饮用水的标准为1ml 水中细菌总数不超过100个；所谓细菌总数，指1mL 水样中所含的细菌菌落的总数。本实验应用平板菌落技术【1】测定水中细菌总数。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基【2】在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板。按菌落计数方法进行计数，通过实验测得的菌数对照国家饮用水标准来判断水质。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。

【关键词】 自来水 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 平板菌落计数技术

引 言：水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含一定数量的微生物。水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来自于人和动物的传染性排泄物。自来水指通过水处理厂净化、消毒后生产出来的符合国家饮用水标准的供人们生活、生产使用的水必须符合国家生活饮用水卫生标准［1］。细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成分，培养温度和时间、pH 、需氧性质等）所得1mL 水样所含菌落的总数。本实验只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。

本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数是用微生物测水质的常用方法。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。通过此方法我们能够计算出水中的细菌总数，从而判断自来水是否符合国家标准，是否受到污

染。

实验用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用

培养基制作平板，计数。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。所谓细菌总数，指1毫升或1克检样中所含的细菌菌落的总数。按菌落计数方法进行计数，得到如下结果：在显微镜下可观察到众多的菌落且种类繁多，取其平均值得到，自来水中细菌总数为87/mL，符合国家饮用水标准。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

(1) 实验材料 自来水

(2) 实验试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 1mol/LNaOH 1mol/LHCl 灭菌水

(3) 实验仪器 高压蒸气灭菌锅 培养皿 三角烧瓶 天平 牛角匙 pH 试纸

（pH5.5-9.0） 吸量管 麻绳 牛皮纸 量筒 玻璃棒 电炉 温度

计

1.2 实验方法

1.2.1灭菌

（1）首先将高压蒸气灭菌锅的内锅层取出, 再向外锅内加入适量的水, 使水面与三角搁架相平

为宜。

（2）放回内层锅, 并加入用报纸包好的培养皿、三角烧瓶、。

（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相

对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，勿使漏气。

（4）用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷空气完全排尽后，

关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力

时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa,121℃,20min 灭菌。

（5）灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时打开

排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。

1.2.2水样的采取

放开水龙头使水流5min 后，用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以待分析。

1.2.3制备牛肉膏蛋白胨培养基

（1）称量

按培养基配方依次准确的称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒

挑取，放在称量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

（2）溶化

在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其

溶解，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。

（3）调pH

在未调pH 前，先用精密pH 试纸测量培养基的原始pH ，如果偏酸，用滴管向培养基

中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸测其pH ，直至pH 达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。

1.2.4细菌总数测定

（1）灭菌吸管吸取1mL 水样，注入其中一套灭菌的培养皿中。共做两个平皿。

（2）分别倾注约15mL 已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上

作平面旋摇，使自来水和培养基混匀。

（3）另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL ，作空白对照。

（4）待培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h ，进行菌落计数。两个平板的平均菌

落数即为1mL 自来水的细菌总数。

2 结果与分析

2.1实验数据与分析

表：自来水中菌落数表实验数据

根据我国饮用水卫生标准规定，每毫升细菌总数37℃培养24 h不得大于100个 [6]，而本实验中测得结果是24个/mL，因此，所取的自来水样符合标准。

2.1.1 对照组中的菌数应为0个，但实验测得数据为60个，这主要是因为有杂菌混入，杂菌来源可能：培养皿灭菌不充分；灭菌后在空气中放置又落入杂菌；培养基倾入培养皿后没有立即加盖；配置培养基时反复升降温（没有立即转移使培养基凝固），使一些杂菌产生抗性; 做实验时灭菌后对着培养基呼气也可能造成细菌污染。所以在以后的试验中必须注意实验操作的严密性。

2.1.2由于培养基是倒置的，所以可以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面。这是

由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，有利于菌落计数。

2.1.3 倒置培养基时应降温至45 ℃，以免温度过高烫死大肠杆菌。切记不能过低，防

止培养基凝固。倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培 养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果。

2.2菌落记数方法［7］

2.2.1 先计算相同稀释度的平均菌落数，若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则

不应采用，而应以为片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数［8］。

2.2.2 首先选择平均菌落数在30～300之间的，则只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的菌落总数。

2.2.3若有两个稀释度的平均菌落数均30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。

2.2.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

2.2.5 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀

释倍数。

2.2.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌

落数乘以稀释倍数。

2.3实验注意事项

2.3.1倒置培养基时应降温至45 ℃左右，温度过高会烫死部分细菌，实验结果受影响，如观察结果中菌落过分稀少就可能是这一因素引起的；温度过低培养基提前凝固，无法倒入

培养皿。

2.3.2倾注培养基后要将培养皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果。

2.3.3培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气中放置，以免杂菌混入。

2.3.4 在实验操作过程中操作者尽量避免对着培养基呼气，人类呼出气体中含大量细菌，可能会影响实验结果，致使菌落数过多。

3．讨论

本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，因此接种过程中务必防止杂菌的侵入。同时要使培养基和自来水样本摇匀，若二者没有摇匀在培养基中可见一些菌苔。由于菌种在固体培养基上是借助重力作用而形成的，所以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面。在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使计数菌落减少。因此，只有在实验不需要精确的情况下才可使用此方法。虽然水中存在大量的细菌且种类繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生长条件的限制，培养基中所得的细菌群落大部分为大肠杆菌，呈圆片状。

[参考文献] [8][6]

［1］ 陈声明, 刘丽丽. 微生物学实验研究方法. 北京：人民教育出版社，1982

［2］ 李根生. 干燥培养基恩德制造及应用. 上海：上海科学技术文献出版社，1994 ［3］ 郝士海. 现代细菌学培养基和生化试验手册. 北京：中国科学技术出版社，1992 ［4］ 罗雪云等 .食品卫生微生物检验标准手册. 北京：中国标准出版社，1995

［5］ 沈萍，范秀容等. 微生物学实验（第四版）. 北京：高等教育出版社.1999 .182～183 ［6］王子石，秦钰惠，郑乃彤. 生活饮用水卫生标准2007.7.1

［7］ 沈萍，陈向东. 微生物学实验[M].4版. 北京：高等教育出版社，2007

［8］ 张清敏，李洪远，王兰. 环境生物学实验技术 2005