基因工程考试题库(便携版)

名词解释 同裂酶（同切点酶）

酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶, 靶序列也各不相同, 但切割后都能产生相同的黏性末端, 酶。 测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA 从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA 全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~很强，测序时常用此酶。与klenow 相比优点是对长片段进行测序的理想用酶。 限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA 列的核酸水解酶。 限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(噬菌体DNA 等) ，使得外源DNA 细胞(如宿主) 自身的DNA 分子合成后，通过修饰酶的作用，特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。 5. 限制性片段长度多态性（RFLP ）：当DNA 性内切酶的识别位点时，或当DNA 因组DNA 电泳区分，出现的这种DNA 多态性称为限制性片段长度多态性。 6. 星号活性：条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。（“非最适的”条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、Mn 2+取代Mg 2+以及高pH 值等。) 克服星号活性的方法：DNA 样品的重新处理等。 7. 载体(vector): 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。克隆载体：主要用于扩增或保存DNA 有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC 和BAC YAC （酵母人工染色体）：载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 BAC （细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli ）的F 高通量低拷贝的质粒载体。 表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、的载体。 病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，构建成的真核基因转移工具。 T-载体：Taq 酶的末端转移酶活性可在PCR 产物的3’依赖于模板的A ，根据这一特性，为方便进行PCR 而开发出T-载体。 Ti 质粒（tumor inducing plasmid ）：定冠瘿病（即可诱发寄主植物产生冠瘿瘤）的质粒。大小在200kb 右。 12. 粘粒载体：由人工构建的、大小一般在 5~7kb左右、含有λ的cos 序列和质粒复制子的一类特殊的质粒载体。 17. 一元载体：含目的DNA 的中间表达载体与改造后的受体（Ti 通过同源重组所产生的一种复合型载体。 18. 双元载体：是指由两个分别含有T-DNA 和vir 区的相容性突变质粒构成的系统。 16. 卸甲载体：将Ti 质粒上的T-DNA 其两边界及与T-DNA 转移所必需的25bp 序列而构建成的载体。 8. 质粒的相容性：是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，够共存则叫相容又叫亲和。 质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象，现象的原因主要是它们常常共用同一复制系统。 9. 转移性：为细菌接合的作用转移到新宿主内。不含tra 移性。 T-DNA ：能导入宿主细胞并插入其DNA 中发挥作用的Ti 质粒部分基因工程考试题库（便携版）

用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源DNA

子能够容易地进入细胞内部。 DNA 为模板, 以单个人工合成

33. 转化子（transformant ）：经转化获得外源遗传物质/DNA为引物, 在Taq 酶作用下, 进行是向有功能缺陷的细胞补充相应功能。 34、感受态（competence ）：作为受体细胞的细菌经一定处理 (RAPD 的分子标记技术。把DNA 进行冷的CaCl2溶液）后处于易于接受外源DNA 的状态。 PCR 扩增(在所有的限制

35. “选择（selection ）” ，3′端辨别作用，呈现具有重组DNA 分子的特定克隆类型的一种方法。 PCR 扩增，只有那些与3′端“筛选（screening ）”则是指通过某种特定的方法，体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组DNA 从而产生DNA 指纹，用荧光法的过程。 36. 启动子：是RNA 聚合酶识别和结合的一段DNA 序列，PCR 反应，可用于测定基因的上游。是基因表达调控的重要顺式元件，具有以下特征：异性；②方向性；③位置特异性；④种属特异性 mRNA 样品构建大容量的

37. 增强子：是能够增强启动子转录活性的一段DNA 序列，件组成，每一个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。 多的每个细胞

38. 沉默子(silencer)：是参与基因表达负调控的一种元件（降低转录高拷贝数效率的一段DNA ） 可随时复制，与染色

39. 绝缘子(insulator)

绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，片段进行重新克隆，即将已克隆不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。 目的在于对目的DNA

40. 衰减子（attenuator ）:衰减发生处的一种内部终止子序列。

结构本身不能实现衰减作用，DNA 疫苗，是利用基因重组挥其作用。 然后直接导入动物体内，通过机体

41. 终止子:为转录提供终止信号的一段DNA 式负调控元件。 从而达到预防和治疗

42. 目的基因：特定基因或DNA 片段。 融合基因：是指应用DNA 个以上的不同基因核苷酸系列的新型基因。 报告基因：是指编码产物能够被快速测定、成功地导入受体细胞（器官或组织），是否表达的一类特殊用途的基因。 以备需要时能够随时应用它分

44、报告基因与选择基因的区别： 选择基因往往要与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞；而报告基因提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，cDNA, 以cDNA 构建赖于外界选择压力的存在。 文库. 。

44. 代表性差异分析：利用了PCR 以指数形式扩增双链模板，而以线形形式扩增单链模板的特性，设计独特的接头和引物，

以指数形式扩增特有序列，通过消减和富集，以纠正或补偿性扩增的一种基因克隆的方法。

48、2цm 质粒：是酿酒酵母含有一个长度为2微米的内源质粒，它微阵列。即在玻片、硅片、薄膜的DNA 分子通常与蛋白质结合构成复合物，存在于核区。2高密度地（点与点之间的距离一般含有自主复制起始区和STB 区，STB DNA 片段或寡核苷酸片段。这持稳定。 DNA 微阵列则称为DNA 芯

49、mRNA 差异技术：也是利用基因在一些组织或器官中的特异表达的原理，将两种组织的mRNA 提取出来，通过反转录和进行电泳，找出差异的带。 杂交过程。针对此缺陷，1996

50、动物生物反应器：SSH 技术。SSH 在保留所谓的动物生物反应器。 cDNA

51、转基因动物：cDNA 相对含量基本胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因整合，。

殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。 当转座子或T-DNA 转入生物基因

52、原位PCR ：是指对组织、细胞中特异DNA 或RNA , 再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。把变异个体的DNA 提胞中的核酸，形态结构不被破坏；与探针原位杂交相比，T-DNA 为模板制备探针，可提高100倍左右。 反向PCR ：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA ，切后的DNA 片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA 片DNA 片段，往往已段扩增出来。 平台效应：在PCR 反应后期，产物的积累按减弱的指数速率增长。DNA 片段两端因： ①底物浓度因消耗而降低，dNTPorprimers ，掺入速度减慢； dNTP 或酶的稳定性下降③末端产物抑制（焦磷酸、dsDNA 性竞争（非特异性引物或引物二聚体）⑤特异性产物自身复性（＞利用载体上的序列为依据，10-8M ）⑥高浓度产物下，变性不彻底。 然后，依次根据前一次测序结

A ．溶液I 的作用是悬浮菌体 B ．溶液Ⅱ的作用是使DNA 变性 C ．溶液Ⅲ的作用是使DNA 复性 D ．质粒DNA 分子小所以没有变

．异戊醇的作用是：（ D ）

A ．使蛋白质脱水 B ．使DNA 脱水 C ．帮助DNA 进入水相

D ．减少气泡，促进分相

．关于PCR 扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中，（ B ）项不

是主要原因。

A ．底物(模板) 过剩 B ．dNTP 的大量消耗

C ．产物的聚集 D ．非特异性产物的竞争性抑制

．线性质粒复制的引物来自于（ B ）

A ．细胞中合成的小分子RNA B ．自身末端的端粒序列

C ．外加的寡聚DNA D ．自身断裂的小分子DNA

．基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（ B ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体

A ．pBR322 B ．pSCl01 C ．pUBll0 D ．pUCl8

．下列哪种克隆载体对外源DNA 的容载量最大? （ C ）

A ．质粒 B ．黏粒 C ．酵母人工染色体(YAC) D ．λ噬菌体

E ．cDNA 表达载体

．反向重复序列：（ A ）

A ．可以回折形成发夹结构 B ．可以是某些蛋白的结合位点

C ．参与转座子的转座 D ．以上说法都不对

．pBR322 是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素

抗性基因来自：（ C ）

A ． ColEl B ．Ri 质粒 C ．pSCl01 D ．pUCl8

．多克隆位点（ B ）

A ．含有许多拷贝的克隆化基因 B ．使得对克隆所用的限制酶的选择具有灵活性

C ．含有许多拷贝的同一种限制酶位点 D ．使得对克隆所用的生物

种类的选择具有灵活性

．下列哪一种不是产生星号活性的主要原因？（ D ） A ．甘油含量过高 B ．反应体系中含有有机溶剂

C ．含有非镁离子的二价阳离子 D ．酶切反应时酶浓度过低 ．DNA 的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是

（ A ）

A ．完整的线性双链DNA B ．单链线性DNA

C ．完整的环状双链DNA D ．开口的双链环状DNA

．同一种质粒DNA ，以三种不同形式存在，电流时它们的迁移率是：（ B ）

A ．OC-DNA > SC-DNA > L-DNA B ．SC-DNA > L-DNA >

OC-DNA C ．L-DNA > OC-DNA > SC-DNA D ．SC-DNA > OC-DNA >

L-DNA ．DNA 被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因

中，那一项不太可能？（ A ） A ．酶失活 B ．蛋白质(如BSA ）同DNA 结合 C ．酶切条件不合适

D ．酶切反应时酶浓度过低 ．下列四个DNA 片段中含有回文结构的是（ D ）

A ．GAAACTGCTTTGAC B ．GAAACTGGAAACTG C ．GAAACTGGTCAAAG D ．GAAACTGCAGTTTC ．目前在高等动物基因工程中广泛使用的载体是（ C ） A ．质粒DNA B ．噬菌体DNA C ．病毒DNA D ．线粒体DNA ．下列哪一种酶作用时需要引物？（ C ） A ．限制酶 B ．末端转移酶 C ．反转录酶 D ．DNA 连接酶 ．下面关于多克隆位点(multiple clone site, MCS)的描述，不正确的—句是（ A ） A ．仅位于质粒载体中 B ．具有多种酶的识别序列 C ．不同酶的识别序列可以有重叠 D ．一般是人工合成后添加到载体中 ．粘性末端连接法，不仅操作方便，而且（ B ） ． 产生新切点 B ．易于回收外源片段 C ．载体不易环化 D ．影响外源基因的表达

1．某学生在用EcoRI 切割外源DNA 片段时，出现了星号活性，请比例则比较低且分离也就比较困难。

分析可能的原因?

5．T4-DNA 连接酶作用机制及提高平末端连接效率的方法。 答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。

2．用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和答：T4-DNA 连接酶的作用机制：

①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。（1 分） 酚相之间?

②E-AMP 上的AMP 转移到DNA 的5′磷酸根上，使其活化，答：酚使蛋白分子间脱水而变性，变性蛋白的密度比水大，释放出酶。（1 分） 因此停在中间。

③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′-磷酸二酯键，3．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，

并释放出AMP 。（1分） 应采取什么措施? 为什么?

提高平头末端连接效率的方法包括： 答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶。这样可以

①加大连接酶用量（10 倍大于粘性末端的连接）。（1 分） 直接在换酶前使第一种酶失活，再加第二种酶，否则易产生星活

②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。（1 分） 性。或使用通用缓冲液除去。

③加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。（1 分）

五、问答题 ④加入单价阳离子（NaCl ），最终浓度150-200 mmol/L。（1 分）

1．碱变性抽提法提取质粒DNA 的基本原理是什么？

答：碱变性抽提法是基于染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的6．简述PCR 技术的基本原理

差异而达到分离目的。在pH 高达12．6 的碱性条件下，染色体答：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单

链DNA 。（1 分） DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA 的大部分

②退火： 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分

多，而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA ，使引物和离。当以pH4．8 的NaAc 高盐缓冲液调节其pH 至中性时，变性

其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间到互补的质粒DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA

的机会较少。（2 分） 不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA 与不

③延伸：在DNA 聚合酶和4 种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在稳定的大分子RNA 、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除

条件下，5`→3`的聚合酶催化以引物为起点的DNA 链延伸反应。去。

（1 分）

2．简述cDNA 文库的概念及构建cDNA 文库的基本操作步骤。 以上3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模答：cDNA 文库是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA 经反转板， 数小时后, 介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大

录产生的cDNA 片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌量复制，数量可达2×106-7 拷贝。（1 分）

中，该群体就称该生物基因组的cDNA 文库。构建cDNA 文库的

7．简述影响Ⅱ型限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？ 基本操作步骤:细胞总RNA 的提取和mRNA 的分离；第一条

cDNA 合成；第二条cDNA 合成；双链cDNA 克隆进质粒或噬菌答：①DNA 样品的纯度：DNA 样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙

醇、EDTA 、SDS 、NaCl 等, 都有可能抑制酶活性。可采用以下方体载体并导入宿主中繁殖。

法，提高酶活性：加大酶的用量，1μg DNA 用10U 酶、加大反

应总体积、延长反应时间（2 分）

3．PCR 引物设计时需要注意哪些基本原则？ ②DNA 样品的甲基化程度：采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来答：①引物长度以20～30bp 为宜，过长过短都会降低特异性，而且制备质粒DNA ，可防止DNA 的甲基化。（2 分）

过长会增加成本。 ③ 酶切反应的温度：多数标准反应温度是37℃，如SmaI 为25℃②引物碱基要随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象，G+C 含或30℃ ，SfiI 为50℃ 。反应温度过度或过低都会影响酶活性，量为45～55%左右。 甚至导致酶失活。（1 分）

③引物内部不应含有回文结构，两个引物之间尤其是3`端不应有④DNA 分子结构：某些酶切割超螺旋质粒DNA 时，酶量比切互补链存在。 割线性DNA 时高出多位，可高达20 倍。（1 分）

④引物的碱基顺序不应与非扩增区有同源性。 ⑤核酸内切酶的缓冲液：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强⑤引物3`末端碱基原则上要求与模板DNA 配对。 度、极端pH 值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生⑥引物5`末端允许有几个碱基不与模板DNA 匹配而呈游离状低特异性，即所谓的“星活性”现象。

态，这不影响扩增的特异性。

⑦引物的5`端一般加有适当限制性核酸内切酶的识别序列，便于8．简述Sanger 双脱氧链终止法的基本原理。

克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 答：在模板指导下，DNA 聚合酶不断将dNTP 加到引物的3’-OH 末 端，使引物延长，合成出新的互补的DNA 链。如果加入双脱氧三

4．与基因文库相比，cDNA 克隆的主要优点与缺点有哪些? 磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故答：主要优点: 不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同

①cDNA 克隆以mRNA 为材料，特别适用于某些RNA 病毒等的5’-引物端和以ddNMP 残基为3’端结尾的一系列长短不一片段基因组结构研究及有关基因的克隆分离。(1 分) 的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA 分子中掺入的位置不②cDNA 基因文库的筛选比较简单易行。(1 分) 同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA ，③每一个cDNA 克隆都含有一种mRNA 序列，这样在目的基因从而读取DNA 核苷酸序列。

的选择中出现假阳性的概率就会比较低，由此选择出来的阳性克

隆将会含有目的基因。(1 分) 9．简述琼脂糖凝胶电泳的基本原理。

④cDNA 克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用答：DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。于基因工程操作。 DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极⑤cDNA 克隆还可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究。(1 移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链分) DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极主要缺点： 方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于①cDNA 文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA 文库，分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。在琼脂糖凝胶电并且受细胞来源或发育时期的影响。 泳中，DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关②cDNA 基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码系。质粒DNA 样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息。 小的标准DNA 片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知③在cDNA 基因文库中，对于低丰度mRNA 的cDNA 克隆所占的该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分

子质量的DNA ，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA 分子。另外在制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB 就插入DNA 分子中形成荧光络合物，使DNA 发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5～lOng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0．01～0．1μg 的DNA 。

10． 什么是细菌的限制—修饰系统? 有什么意义?

答：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和

改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。

11． 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响?

答:Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异

性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量＞5％，v ／v) ；(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／μg DNA)；(3)低离子强度(

(5)含有有机溶剂，如DMSO ，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等) 。