LIT联合IVIG被动治疗封闭抗体阴性RSA的封闭抗体转阳情况及妊娠率效果
LIT 联合IVIG 被动治疗封闭抗体阴性RSA 的封闭抗体转阳情况及妊娠率效果
【摘要】目的：探讨LIT （淋巴细胞主动脉免疫治疗）与IVIG （静脉注射免疫球蛋白）被动治联用对封闭抗体阴性RAS （复发性流产）患者的治疗效果。方法：选取我院收治的150例封闭抗体阴性的RAS 患者作为研究对象，使用随机数字法分为联合组与对照组（n=75），对照组单纯行LIT 治疗，联合组联合采用LIT 和IVIG 进行治疗，对比两组患者的封闭抗体转阳率、妊娠成功率及免疫细胞水平变化。结果：联合组治疗后的CD56+CD16+水平为（12.10±
5.25）%，显著低于对照组，联合组治疗后的CD4+CD5+水平为（14.08±3.82）%，显著高于对照组，P
【关键词】封闭性抗体；复发性流产；LIT ；IVIG
复发性流产（Recurrent Spontaneous Abortion, ，RSA ）指的是女性与同一性伴侣连续发生2次或多次的自然流产，据统计资料显示我国女性的RSA 发病率在10~15%之间，并且近几年来随着人们性观念的不断开放，RSA 的临床患病率也呈现出了显著的上升趋势[1]。内分泌失调、生殖系统解剖异常、免疫紊乱、感染、基因变异等均可导致RSA 发生，其中免疫紊乱被认为是RSA 发病的主要因素。免疫紊乱最常见的一种表现形式就是封闭抗体阴性。有研究显示[2]，孕妇体内封闭抗体检测结果呈阴性者的流产率显著高于封闭抗体阳性者，提示封闭抗体阴性会使流产的风险显著升高。现阶段，临床治疗封闭抗体阴性RSA 主要采用淋巴细胞主动免疫疗法，或免疫球蛋白被动免疫疗法，实践应用也得到了一定的成效。但临床较少将主动免疫疗法和被动免疫疗法联合用于RSA 治疗。我院对封闭抗体阴性的RSA 患者联合采用LIT 和IVIG 进行治疗取得了较为满意的效果，报道如下。
1 一般资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 纳入标准
连续发生2次或多次自然流产；无死产、死胎史；封闭抗体检测结果呈阴性；夫妻双方均未发现异常染色体；生殖道解剖正常；自身免疫抗体（如抗HCG 抗体、抗卵巢抗体、抗精子抗体、抗核抗体、抗心磷脂抗体等）呈阴性；甲状腺、内分泌激素检查结果正常。
1.1.2 排除标准
支原体、衣原体、病毒等感染者；凝血功能异常者；男方或女方有家族性遗传病或染色体异常；合并生殖系统疾病或生殖道畸形者；男方或女方伴有性传播疾病。
1.1.3 研究对象
选取我院在2015年5月~2016年5月收治的150例封闭抗体阴性RAS 患者作为研究对象。使用随机数字表法分为两组（n=75）：联合组年龄20~41岁，平均（28.52±1.57）岁，流产2~7次，平均（3.02±2.11）次；对照组年龄22~39岁，平均（29.02±1.62）岁，流产2~9次，平均（3.10±2.09）次。两组的年龄、流产次数相当，无显著差异（P>0.05），可进行比较。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂
BD FACS Calibur型流式细胞仪；免疫球蛋白；胎牛血清；RPMI-1640细胞培养液；红细
胞裂解液；淋巴细胞分离液；鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC/CD19-PE，CD16-TC/CD56-PE、CD4-FITC/CD25-PE、IgG2a-FITC 、IgG1-PE 。
1.2.2 治疗方法
对照组患者单纯采用LIT 治疗。采集30ml 患者配偶的外周静脉血，提取淋巴细胞，洗涤3次，配制成3ml 浓度为2~4×107/ml的淋巴细胞悬液，在患者上臂取6个点进行皮内注射，每个月应用1次，持续治疗4次为1疗程。患者在治疗期间使用避孕套避孕。1个疗程的治疗结束后，对患者的血清封闭抗体进行复查，对于复查结果阳性者，开始准备受孕，对于复查结果阴性者，继续进行LIT 治疗，治疗方法同前。治疗2个疗程后，开始准备受孕。成功妊娠的患者，继续进行LIT 治疗，到孕12周停止LIT 治疗。妊娠期间同时肌注2000U HCG，每日1次，直至孕8周停用，肌注20mg 黄体酮，每日1次，直至孕12周停用，口服100mg 维生素E ，每日1次，直至孕12周停用。
联合组联合采用LIT 和IVIG 进行治疗，即在对照组治疗基础上加用IVIG 被动治疗。在患者受孕当月月经周期第8~10天静脉注射1次免疫球蛋白，剂量25g ，每月1次，持续治疗3个月。明确妊娠后，每周静脉注射1次免疫球蛋白，剂量25g ，直至12孕周停用。
治疗期间，无一例患者出现发热、感染等不良反应。部分患者在注射淋巴细胞后有轻度的局部红肿，症状轻微，未进行特殊处理，2~3d后自行消退，局部无硬结。所有患者在完成治疗后，通过电话及门诊复查的方式随访12个月以上。
1.3 观察指标
（1）在治疗前及治疗后（对照组在备孕第一个月的月经周期11~13天，联合组在第一次行IVIG 治疗后第3天），采集静脉血，使用肝素抗凝保存，采血后6h 内使用流式细胞仪进行免疫细胞水平检测，检测指标包括CD3+CD19+、CD56+CD16+、CD4+CD5+。（2）记录、比较两组患者的妊娠成功率。妊娠时间≥28孕周，判定为妊娠成功。妊娠成功率=妊娠成功例数/总例数×100%。（3）治疗后（对照组在备孕第一个月的月经周期11~13天，联合组在第一次行IVIG 治疗后第3天），对两组患者进行血清封闭抗体复查，检测结果呈阳性，则判定为封闭抗体转阳，比较两组的封闭抗体转阳率（封闭抗体阳性例数/总例数×100%）。（4）两组患者均随访至分娩，记录早产、死产、足月产等情况。
1.4 统计学方法
数据处理用SPSS20.0软件，计数、计量资料比较分别进行x 2检验和t 检验，以P
2 结果
2.1 免疫细胞水平
两组患者治疗前各项免疫细胞水平比较均无显著差异（P>0.05）；治疗后，两组的各项免疫细胞水平均有显著改善，两组治疗后的CD3+CD19+水平相当（P>0.05），联合组治疗后的CD56+CD16+水平显著比对照组更低，CD4+CD5+水平显著比对照组更高，P
表1 两组患者治疗前后的免疫细胞水平比较（ s ，n=75）
组别
联合组
对照组
t
P CD3CD19（%） 治疗前 11.52±3.85 11.63±4.05 0.170 0.866 治疗后 10.12±3.14 10.77±4.36 1.048 0.301 ++CD56CD16（%） 治疗前 16.57±5.28 16.62±6.35 0.052 0.959 治疗后 12.10±5.25 15.04±4.33 3.741 0.001 ++CD4CD5（%） 治疗前 6.36±2.08 6.28±3.27 0.179 0.859 治疗后 14.08±3.82 11.24±4.26 4.298 0.000 ++
2.2 封闭抗体转阳率、妊娠成功率
两组患者均顺利完成治疗，无中途退出或失访病例。联合组的封闭抗体转阳率、妊娠总成功率均显著高于对照组，P
例患者中，妊娠成功9例（90.00%），对照组治疗后封闭抗体阴性的23例患者中，妊娠成功11例（47.83%），联合组封闭抗体阴性患者的妊娠成功率显著高于对照组，x 2=11.506，P
表2 两组患者的封闭抗体转阳率、妊娠成功率比较[n]
组别
联合组
对照组
x 2
P 例数 75 75 封闭抗体转阳 例数 65 52 百分比/% 86.67 69.33 8.761 0.003 例数 70 60 妊娠成功 百分比/% 93.33 80.00 7.688 0.006
2.3 随访结果
随访至分娩，结果显示联合组妊娠成功的70例患者中，早产5例，足月产65例，早产率7.14%，无死产；对照组妊娠成功的60例患者中，早产4例，足月产56例，早产率6.67%，无死产。两组患者的妊娠结局良好，早产率比较无显著性差异（x 2=0.017，P
近年来，随着临床免疫细胞学研究的不断深入，免疫因素在RSA 中的作用也引起了人们的高度重视。胚胎的基因是由母系和父系共同组成的，妊娠可视为一个半同种基因的种植过程，在这一过程中，母体需要进行精细的免疫调控让胚胎形成免疫耐受，以免母体的免疫系统对胚胎产生排斥而发生流产[3]。按照免疫异常类型的不同，临床将RSA 分为同种免疫和自身免疫两种类型，前者在临床上最为多见。
由于白细胞抗原的基因具有多态性，夫妻双方的白细胞抗原一般都不相容，所以母体在妊娠后会产生封闭抗体覆盖男方白细胞抗原，以阻断母体淋巴细胞对胚胎滋养细胞的毒性作用[4-5]。封闭抗体是存在于正常孕妇血清中的抗配偶淋巴细胞的特异性IgG 抗体，其能对淋巴细胞反应发挥抑制作用，封闭母体淋巴细胞对滋养层的细胞毒性，阻断母体免疫系统对胚胎的攻击，封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移动抑制因子。若男方和女方白细胞抗原多个点位的相容性较大，或者双方有相同的滋养细胞淋巴细胞交叉反应抗原，则难以产生大量的封闭抗体，也就无法起到保护胚胎滋养细胞免受母体细胞攻击的作用，所以极易反复发生流产[6]。
目前，临床治疗封闭抗体阴性RSA 的方法主要有两种，一是主动免疫治疗，二是被动免疫治疗。主动免疫疗法治疗RSA 的原理是通过提取患者或他人的淋巴细胞，经上臂皮下注射，以诱导机体产生封闭抗体，促使封闭抗体转阳，从而避免胚胎受到母体免疫系统的攻击，防止流产。而被动免疫疗法治疗RAS 的原理是通过静脉注射免疫球蛋白的方式，来调节Th1和Th2细胞亚群比例，降低自然杀伤细胞数量，增加封闭抗体水平，从而抑制母体对胎盘的排斥反应，预防流产[7-9]。据文献报道[10]，RSA 患者单纯使用主动免疫疗法，或单纯使用被动免疫疗法的成功率约为60~80%，而单纯行主动免疫疗法失败者的原因主要为治疗后仍未产生足够的封闭抗体。封闭抗体水平不足，则无法有效阻断母体免疫系统对胚胎的攻击，容易造成流产，所以要顺利维持妊娠，就必须提高封闭抗体水平，促使封闭抗体转阳，以充分发挥胚胎滋养细胞保护作用。本次研究结果显示，联合组的封闭抗体转阳率显著高于对照组，说明比起单纯的LIT 治疗，LIT 与IVIG 联用更能有效提高RSA 患者的封闭抗体水平，促使封闭抗体转阳。这可能是因为比起单纯LIT 治疗，LIT 与IVIG 联用的免疫调节路径更多。结果还显示联合组妊娠成功率明显高于对照组，封闭抗体阴性患者的妊娠成功率也显著高于对照组。这一结果与国内多篇文献报道[11-12]结果相符，说明联合应用主动免疫疗法和被动免疫疗法，能够有效提高RSA 患者的妊娠成功率，特别是封闭抗体阴性者的妊娠成功率。这可能是因为LIT 与IVIG 联用，在妊娠初期静脉注射免疫球蛋白能够有效抑制母体对胚胎的排斥反应，特别是封闭抗体仍呈阴性的患者，免疫球蛋白的应用更能够起到保护胚胎的作用，
而单纯LIT 治疗下，封闭抗体仍呈阴性者则不具有这一保护，所以联用IVIG 治疗的妊娠成功率更高。
CD19是一种参与B 细胞活化过程的受体，CD3+CD19+细胞数量反映了B 细胞活化程度，其能准确反映机体的细胞免疫情况。本次研究结果显示两组患者治疗后的CD3+CD19+水平均有所降低，但降幅并不显著。由此推测主动和被动免疫疗法的作用对象可能并不是B 细胞表面受体。CD4+CD25+是一类具有免疫抑制作用的T 细胞亚群，其能对抗原提呈作用加以抑制，同时分泌穿孔素/颗粒酶，诱导T 细胞功能及表型变化，从而发挥免疫抑制作用。在妊娠过程中，CD4+CD25+是维持正常妊娠必不可少的T 细胞亚群，RSA 患者体内的CD4+CD25+水平普遍较低，所以母体的免疫抑制作用较弱，胚胎更容易遭受免疫攻击。本次研究结果显示，两组患者治疗后的CD4+CD25+水平显著升高，且联合组的CD4+CD25+水平显著比对照组更高，P
综上所述，对于封闭抗体阴性RAS 患者联合采用LIT 和IVIG 被动治疗，能够有效调节机体免疫功能，促进封闭抗体转阳，提高患者的妊娠成功率，尤其是治疗后封闭抗体阴性者的妊娠成功率，临床应用优势显著，值得推广。
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