地衣芽孢杆菌耐高温淀粉酶的酶学特性
南京农业大学学报 2004,27(1):63～66
地衣芽孢杆菌WB211菌株耐高温α2淀粉酶的酶学特性
陈红歌1,顾溯海2,任随周2,马向东2,贾新成23
(1.南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,江苏南京210095;
21河南农业大学生物工程学院,河南郑州450002)
摘要:从地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中分离到一α2淀粉酶组分,经PAGE及SDS2PAGE检测为电泳均一的纯酶蛋白。该酶最适反应温度为95℃,50和70℃条件下酶活性稳定,90℃保温30min残余酶活力为2819%。该酶最适作用
pH为610～615,在pH510～810内稳定。酶的相对分子质量为65900,等电点6194,对可溶性淀粉的Km值为0141mg・mL-1。Ca2+、Mn2+、Cu2+、Co2+及Ba2+对酶具有激活作用,其中Ca2+激活作用最显著,且以4～8mmol・L-1浓度为最
适。Ca2+还能显著提高酶的热稳定性,4mmol・L-1Ca2+,90℃保温30min,83%。关键词:耐高温α2淀粉酶;地衣芽孢杆菌;酶学特性中图分类号:TQ925+11 文献标识码:A 文章编号:(α2amylasefrom
strainWB211
CHENHong2ge1,GUSu2hai2,RENSui2zhou2,MAXiang2dong2,JIAXin2cheng23
(11KeyLaboratoryofMicrobiologicalEngineeringofAgriculturalEnvironment,MinistryofAgriculture,
NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;21BioengineeringCollege,
He′nanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)
Abstract:Anα2amylasewasisolatedfromBacilluslicheniformisandidentifiedaselectrophoreticallyhomogeneousbymeansofPAGEandSDS2PAGE1Theoptimumtemperatureoftheamylasewas95℃anditwasstableat50℃aswellas70℃.Afterincubatedat90℃for30minutes,theresidualactivityoftheamylasedecreasedto2819%.TheoptimumpHoftheamylasewas610615anditsactivitywasstableatpHrangeof510810.Themolecularweightoftheenzymewas65900anditsisoelectricpointwas6194,anditsKmtosolublestarchwas0141mg・mL-1.TheamylasewasactivatedbyCa2+,Mn2+,Cu2+,Co2+andBa2+ions,amongwhich,Ca2+wasthemostremarkablewiththeoptimumconcentrationof48mmol・L-1.Besides,Ca2+canalsoenhancethethermalstabilityoftheamylase.Theresidualactivityoftheenzymeincreasedfrom2819%to83%afterincubatedat90℃for30minutesatthepresenceof4mmol・L-1Ca2+.Keywords:thermostableα2amylase;Bacilluslicheniformis;enzymecharacteristics
耐高温α2淀粉酶是指最适反应温度较高(一般在80℃以上)且在高温下(80℃以上)较稳定的α2淀粉酶,是近年开发的一种新型液化型酶制剂。由于其作用温度高、热稳定性好,而具有重要的工业应
用价值。近年来人们进行了广泛的研究,并有不少报道[3～8]。本文以一株高产淀粉酶的地衣芽孢杆菌为产酶菌株,对其所产高温α2淀粉酶的酶学特性进行了研究,以期为该酶的生产及应用提供指导。
1 材料与方法
111 高温α2淀粉酶的制备
11111 菌种 地衣芽孢杆菌(B1licheniformis)WB211,由南京农业大学农业部农业环境微生物工程重
收稿日期:20030108
基金项目:河南省科技厅重点科技攻关项目(0123011700)
3 作者简介:陈红歌(1967,博士研究生。通讯作者Correspondingauther:贾新成(1942),教授,博导,主要从事微生物酶学研
究。Tel:[1**********],E2mail:jxch43@1631com
南 京 农 业 大 学 学 报 第27卷・64・
点开放实验室保存。
11112 培养基 种子培养基(g・100mL-1):牛肉膏012,蛋白胨015,酵母粉012,NaCl0135,K2HPO40136,KH2PO4011。发酵培养基(g・100mL-1):豆饼粉215,棉子饼粉2,玉米浆2,乳糖5,(NH4)2SO4015,K2HPO4115,KH2PO4015。
11113 粗酶液制备 从淀粉平板上挑取透明圈较大的单菌落,接种于含种子培养基的三角瓶中,37
℃、200r・min-1振荡培养至对数生长期;以2%接种量接入含发酵培养基的三角瓶中,37℃、300r・min-1振荡培养120h。将发酵液离心,去除菌体及培养基残渣,即得粗酶液。
α11114 2淀粉酶酶谱检测 将粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后,取出凝胶,从中间切开,
一半进行考马斯亮蓝染色,另一半浸入2g・100mL-1淀粉溶液(用012mmol・L-1、pH610的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液配制),于0℃放置30min。然后将胶置于稀碘液中显色,根据透明条带出现的位置,对照考马斯亮蓝染色结果,确定α2淀粉酶的酶带。
11115 酶的分离与纯化 采用制备型PAGE凝胶电泳分离与纯化[11]。
112 酶学特性测定
11211 酶活力测定 采用比色法
[9]
。以70℃,pH610h1个
酶活力单位。11212 酶的最适反应温度 在50～100,。以最适反应温度下测得的酶活力为100%。
11213 酶的最适2氢氧化钠缓冲体系配制pH值依次为
410、415、510、51、6710、715、810、910、1010的系列缓冲液,分别代替11211方法中的pH610的缓冲液进行酶活力测定。以最适反应pH下所测得的酶活力为100%。
11214 酶的热稳定性 将酶液分别在50、70及90℃保温,间隔5、10、15、30、60、120和240min取
样,按常规方法测残余酶活力。以未保温的酶液活力为100%。11215 pH稳定性试验 用磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲体系和甘氨酸2氢氧化钠缓冲体系配制pH410～1010的系列缓冲液,将酶液与不同pH值的缓冲液混合,于40℃保温1h后,按常规方法测定残余酶活力。以未处理的酶液活力为100%。11216 米氏常数Km值的测定 将配制浓度依次为0108、012、014、016、018、110、112和114g・100mL-1的可溶性淀粉溶液,置于70℃水浴中预热5min,各加1mL酶液,反应5min。加1mL蒸馏水于
不同底物浓度的溶液中作空白对照,同时进行反应。于沸水浴中终止反应。用DNS法测定还原糖量,得到不同底物浓度时的初速度值(以每分钟生成的葡萄糖量表示)。利用双倒数作图法求得Km值。
11217 等电点的测定 用Vesterberg薄层凝胶等电聚焦法[10]。两性电解质ampholinepH315～10,为
LKB公司产品,在上海农业科学院食用菌研究所测定。
测定。11219 不同金属离子对酶活力的影响 在测定酶活力的反应体系中分别加入终浓度为4mmol・L-1的不同金属离子,按常规方法测定酶活力。以未加金属离子的酶活力为100%。112110 不同浓度Ca2+对酶的激活作用 在测定酶活力的反应体系中分别加入终浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10mmol・L-1的CaCl2,按常规方法测定酶活力。以未加Ca2+的酶活力为100%。
11218 相对分子质量测定 采用SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳法112111 Ca
2+
[11]
对酶的热稳定性影响 将酶液置于终浓度为4mmol・L-1的CaCl2溶液中,在90℃下保温,
于不同时间取样,按常规方法测定残余酶活力。以未加Ca2+、未保温的酶活力为100%。
2 结果与分析
211 酶的制备与纯化
经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,得到一α2淀粉酶组分。经PAGE及SDS2PAGE凝胶电泳检测,所分离的酶为纯酶蛋白(图1、图2)。
第1期 陈红歌等:地衣芽孢杆菌WB211菌株耐高温α2淀粉酶的酶学特性
・65・
212 酶学特性
21211 最适反应温度及热稳定性 酶
的适合反应温度为75～100℃,最适反应温度为95℃,因此该酶为耐高温α2淀粉酶。酶的热稳定性试验表明,该酶在50和70℃下能稳定保持活性,在90℃下保温30min,残余相对酶活力为2819%,保温60min时,酶活力已基本全部丧失。21212 最适pH及pH稳定性 酶的适合作用pH范围为510～810,最适pH为610～615,在pH610～810内酶
活
11粗酶液Crudeenzyme;21分离酶带Isolatedamylase;31淀粉酶酶谱检测Zymogramofisolatedamylase
11粗酶液Crudeenzyme; 2,3,41不同
批次分离所得酶Isolatedamylasefromdif2
ferenttimes
图1 酶的PAGE及酶谱检测 Fig11 PAGEandzymogram
ofisolatedamylase
图2 酶的SDS2PAGE检测 Fig12 SDS2PAGEofisolated
amylase
性变化不大。酶的pH稳定性试验表明,该酶在pH510～810,90%内,同时还可看出该酶的最适作用pH范围与稳定
pH21213 酶的相对分子质量 用标准蛋白的分子质量对数对其相对迁移率作图,酶的相对分子质量为65(21214 离对其等电点作图),求出该酶的等电点(pI值)为6194。21215 酶的Km值 从图5中可求得-1/
Km=-2146,即Km=0141mg・mL-1。21216 金属离子对酶活力的影响 从表1
可以看出,4mmol・L-1的Ca2+、Mn2+、
Cu2+、Co2+及Ba2+对酶具有激活作用,其图3 SDS2PAGE凝胶电泳图谱中以Ca2+的激活作用最强;而Ag+、Hg2+、Zn2+对酶具有不同程度的抑制作用。
Fig13 Determinationofmolecu2
larweightoftheamylasebySDS2PAGE
图4 等电聚焦电泳测定等电点
Fig14 Determinationofisoelec2
tricpointoftheamylasebyPAGIF
表1 不同金属离子(4mmol・L-1)对酶活力的影响
Table1 Effectofmetalionsonactivityoftheamylase
金属离子
AgNO3BaCl2CuCl2
相对酶活力/%
713
1231314713
2+
金属离子
CoCl2
LiClCaCl2
相对酶活力/%
13611
1121715615
金属离子
MgCl2MnCl
2FeCl3
相对酶活力/%
11413
152148113
金属离子
AlCl3HgCl2ZnCl2
相对酶活力/%
7315
21124610
对酶的激活
作用 在测定酶活力反应体系中加终浓度为1、2、3、4、5、6、7、
21217 不同浓度Ca
8、9和10mmol・L-1CaCl2,其相对
酶活力(%)分别为101、10918、11415、15418、14714、14312、13416、13615、10411和10017。可见,4～8mmol・L-1的Ca2+对α2淀粉酶具有显著的激活作用,Ca浓度过低或过高则对酶的激活作用不明显。
2+
图5 双倒数作图求酶的Km值
Fig15 Determinationof
Kmofthe
amylasebyconstructingthefig1of1/Vvs1/[S]
图6 Ca2+对酶热稳定性的影响
Fig16 EffectofCa2+onthermalsta2
bilityoftheamylase
南 京 农 业 大 学 学 报 第27卷・66・
对酶的热稳定性影响 从图6可以看出,在90℃下,不加Ca2+时,保温30min后仅能剩
余2819%的酶活力,加入Ca2+30min后能保持83%的酶活力,且60min后尚有3215%的酶活力。表明,加入4mmol・L-1的Ca2+能显著提高α2淀粉酶的热稳定性。
21218 Ca
2+
3 讨 论
Kindle[12]综述了耐高温α2淀粉酶的性质及产生菌,其中以地衣芽孢杆菌所产α2淀粉酶最适反应温度
最高,为76～95℃,酶的半失活温度t1/2为80～95℃。国内报道的地衣芽孢杆菌α2淀粉酶的最适反应
[3～5]温度多为90℃。本文纯化的地衣芽孢杆菌WB211菌株的α2淀粉酶最适反应温度为95℃,将其置于90℃下保温30min,酶活丧失至2819%,而在有4mmol・L-1Ca2+时,酶活力即可保持83%,这说明该酶在测定酶活力的反应条件下(反应时间仅5min)可在95℃发挥最大的酶活力。但在热稳定性方面,该α2淀粉酶纯化酶不耐受90℃高温处理,但在有Ca2+存在时,热稳定性显著提高,说明其完全适合工业上高温水解淀粉的应用,加之该酶具有比以上报道较低的Km值,,酶作用效率高,因此该菌株经过选育有可能成为新的α2参考文献:
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责任编辑:夏爱红