双脱氧末端终止法论文

深圳大学考试答题纸

(以论文、报告等形式考核专用) 二○一三～二○一四 学年度第 一 学期

课程编号 23220027

02 课程名称 遗传学发现

姓名 专业年级 主讲教师 王亮 评分 学 号

10级土木3

题目： 双脱氧链终止法的进展及其在现代医学中的应用和意义

【摘要】自1977年,Sanger 双脱氧链终止法为代表的第一代测序技术确立以来，在三十多年里，DNA 测序技术已经取得了重要的进展。测定DNA 的核苷酸序列，对于了解基因及其结构、基因表达、及其表达的调控机制，乃至对于基因改造和分子进化研究等方面，均具有重要的意义。本文就双脱氧链终止法为代表的DNA 测序的进展及其在现代医学中的应用和意义作一简单介绍。

【关键词】双脱氧链终止法，进展，意义

一、引言

DNA 序列分析是基因工程和分子生物学领域最重要的技术之一, 是了解基因结构和功能的基础。DNA 分子中核苷酸的排列顺序是生物体中最基本的结构, 几乎一切生物遗传信息都编码在DNA 的核苷酸序列之中。DNA 序列快速分析技术的广泛应用, 有力地推动了生物学的迅速发展。七十年代中期Sanger 和Gilbert 的DNA 序列快速分析技术的出现使人们能够深入观察到生物基因结构与调控关系。双脱氧链终止法测序是Sanger 等于1977 年建立起来的。这一方法与同期出现的Maxim －Gilbert 化学降解法，都被认为在DNA 序列测定诸方法中最为快速、简便、准确。尤其是Sanger 双脱氧链终止法测序原理简单，操作容易，能为一般实验室所接受，目前成为世界各实验室测序的主要方法。

二、Sanger 双脱氧链终止法的基本原理

Sanger 的“双脱氧”DNA 序列分析法是在“加，减”法的基础上，经过改进建立的。其基本原理是: 核酸模板在DNA 聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP, 其中的一种用放射性P32标记) 存在条件下复制时, 在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddNTP),因为双脱氧核苷没有3′-OH, 所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,

该链就停止延长, 若链端掺入单脱氧核苷, 链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后, 分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后, 根据片段3′端的双脱氧核苷, 便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

三、双脱氧链终止法的进展

在Sanger 链终止测序的基础上，逐渐形成了越来越完善的序列测定系统。早期，Messing 等构建了丝状噬菌体M13克隆载体。通过分子克隆技术将目的DNA 到单链线状噬菌体M13载体上，提取单链模板用于序列测定。之后, 人们在DNA 序列分析的基本策略、提高测序的精度及效果等方面进行了不懈的努力。例如,1982 年, 洪国藩建立了“非随机”DNA 序列测定法, 使测序速度明显提高；由于双链DNA 测序省去了M13测序亚克隆的构建这一步骤, 近些年来倍受欢迎；使用碱基类似物dITP 或7-deaza-dGT P 取代dGTP, 减少了凝胶电泳后压缩效应给阅读带来的麻烦；各种DNA 聚合酶的改进, 如人工修饰的T 7DNA 聚合酶( 也称测序酶Sequenase) ；使用S-dATP 标记和缓冲液梯度胶分离, 改善了电泳图谱的可读性, 增加DNA 顺序的可读长度等等。

随着人们对放射性同位素对人体危害的进一步认识, 在许多实验室已经使用非放射性物质取代放射性同位素。利用地高辛和生物素测序是近年来发展的一种测序手段。其酶学部分利用了双脱氧法的原理, 但在测序反应体系中, 以非放射性标记物(如地高辛、生物素) 代替放射性同位素示踪测序反应的产物, 最后通过酶显色反应显示出测序结果。

1987 年美国ABI 公司推出了DNA 序列自动测定仪, 它集合双脱氧法、荧光标记法和激光检测法于一身, 利用检测器与计算机联合完成。这种自动测序仪的原理仍沿用Sanger 等建立的双脱氧链终止法, DNA 聚合酶催化延伸反应产生的DNA 片段仍需通过序列胶电泳分离, 但都采用了无放射性伤害的荧光标记物。ABI 公司的研究人员经长期实践摸索, 最终确定了四种荧光基团分别作为DNA 聚合酶延伸反应中四种ddNTP 终止的DNA 片段的标记物。这种自动测序仪的出现，使DNA 序列分析又得到一次飞跃, 它更简便、更快捷, 使测序的便利性，安全性及获得的通量均大大的提高了。

四、双脱氧链终止法在现代医学中的应用和意义

DNA 序列分析是DAN 的一级结构分析，DNA 一级结构分析是测定DNA 链中棱苷酸的排列顺序，从而知晓其核苷酸的组成、数量和相互问的比例，获得基因组结构的资料。1977年Sanger 等发明的DNA 双脱氧链末端终止测序法，Maxam 和Gilbert 发明的DNA 化学降解测序法，标志着第一代测序技术的诞生。其中因Sanger 双脱氧链终止法因操作简便, 得到广泛的应用，推动了DNA 序列分析的快速发展，在医学中也得到了广泛的应用。

各种生物的DNA 均由腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶四种脱氧核苷酸(常简写成

A 、c 、G 和T) 以不同的比例及排列顺序组合成生物大分子，如人类DNA 由3×103 个核苷酸残基对组成。DNA 是生物性状遗传的物质基础，蕴藏着生物的遗传信息，主要存在于细胞核的染色质。遗传信息在DNA 内是如何组织的，物种、种族及个体之间有何差异，只有对DNA 作序列分析才能回答这些问题。只有DNA 序列分析资料才能揭开生物遗传奥秘的症结。人类要真正认识自己，亦必须包括彻底了解自身遗传物质组织的详图，这是显而易见的。因而，1990年美国制定了世界上最庞大的基因研究计划—— “人类基因组项目”, 拟定在15年内完成对人类基因组的全部DNA 序列分析、定位及遗传学的研究。这是一项巨额耗资又需要全世界科技工作者长期努力协作的项目。虽然是一项谈何容易的工程，但却是一项必须做的事业，已引起许多国家的热烈响应。此外，人类要掌握生命世界的主动权，还必须认识其他生物遗传物质组织的细节和特征。如农业畜牧业上良种的选择，医学科学对病原微生物的控制等，都必须了解相应物种遗传物质的组织特征。这些问题也只有通过DNA 序列分析才能得到圆满解决。

DNA 序列分析是最终确定基因组结构的方法。对鉴定病原微生物的变异种、株，种间差异，生化进化的保守性．亲缘关系等是非常有力的手段。测序可用于病原体基因组分析，是研究病原体基因变异的基础，如流感病毒抗原漂移、抗原转变，病毒基因进化分析，病原体型别分析，未知病原体鉴定等等。技术的不断改进和发展，以及自动化仪器如序列阅读仪的面世，使序列分析的效率快速提高。

在人类的疾病中, 由遗传因素或主要由遗传因素决定的疾病, 称谓遗传病。其中的一部分是由基因组某个基因座上存在致病基因而引起的, 此类遗传病称为单基因遗传病，如: 地中海贫血、血友病、白化病等。另一些疾病则是由多个基因座位存在有缺陷基因, 这些缺陷基因相互协同作用所致。在许多情况下, 这些缺陷基因还需要一定的环境因素参与, 才能致个体发病, 这一类疾病称谓多基因遗传病, 如: 高血压、糖尿病、冠心病、肿瘤等等。人类基因与疾病的研究已涉及人体各个系统各类疾病, 包括传染病、非传染病、急性病、慢性病。随着研究的深入将发现更多的疾病与基因有关, 有更多的病可以通过基因治疗而被治愈。

由于D N A 序列快速分析方法的出现, 人们获得了基因重叠, 基因中的“ 内含子” 和线粒体遗传密码使用的特殊情况等重大发现, 使得分子生物学不断地发展和前进, 其中许多基本的理论要不断修改给予新的概念。

五、结语

DNA 测序的研究工作, 历经了数十年, 成绩辉煌, sanger 也曾获得两次诺贝尔奖。“基因组计划”对人类提出了严峻的挑战, 使许多科学家在对原有技术进行不断的改进、完

善的同时, 亦致力于发展更加快速、简捷、经济的高速测序新方法、新技术。目前已经到了第三代, 三代测序技术有各自的优势。第一代测序技术虽然成本高, 速度慢, 但是对于少量的序列来说, 仍是最好的选择, 所以在以后的一段时间内仍将存在；第二代测序技术刚刚商用不久, 正在逐渐走向成熟；第三代测序技术有的刚刚出现, 有的则正在研制, 相信很快便可进行商业化运作。可以预见, 在未来的几年里会出现三代测序技术共存的局面。测定人类整个基因组顺序的计划的成败将在很大程度上取决于有无更加有效的DNA 测序技术的出现, 而新技术的出现也必将推动分子生物学的迅速发展。

参考文献

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