显微镜的使用和革兰氏染色法
普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法
摘要：微生物的最显著特征就是个体微小，一般必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本实验只要是学习并掌握油镜的使用及革兰氏染色的方法和步骤，巩固平板划线分离法及无菌操作技术。 关键词：显微镜 油镜 革兰氏染色法
1前言
1.1实验目的
1. 学习并掌握普通光学显微镜及油镜的原理和使用方法。 2. 掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌等在光学显微镜下的基本形态特征。
3. 学习细菌染色的原理和方法。
4. 掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 5. 巩固平板划线分离法及无菌操作技术。
1.2 实验原理
1.2.1 显微镜的使用
在普通显微镜（图1）通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物研究最为重要，与其它物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和物镜间加滴镜油（通常用香柏油），这主要有以下两方面的原因：①增加照明亮度 从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射不能进入镜头，致使摄入光线较少，物象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时必须在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（ｎ＝1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率ｎ＝1.52）。光线通过载玻片可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射（接物镜油浸系），使视野增加进光量，这样就能使物像更加清晰。详见图2 ②增加显微镜的分辨率
图1 图2 1.2.2 革兰氏染色法
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌
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学上最常用的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮) 脱色，最后用复染剂(如番红) 复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色) ，该菌属于革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和组成的差异所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色
2材料与方法
2.1 材料
2.1.1菌种
大肠杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 2.1.2溶液和试剂
香柏油，二甲苯，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等。 2.1.3仪器和其他用品
酒精灯，载玻片，普通光学显微镜，擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。
2.2方法与步骤
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2.2.2显微镜的操作步骤
2.2.3 革兰氏染色实验步骤
3结果与分析
3.1简单染色的实验结果
经简单染色的大肠杆菌呈现紫色，细菌形态为杆状。如图3所示。
3.2革兰氏染色的实验结果（见下表，附图）
革兰氏染色后实验结果
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图3 简单染色后的大肠杆菌 图4 革兰氏染色后的大肠杆菌
图5 革兰氏染色后的金黄色葡萄球菌 图6 革兰氏染色后的枯草杆菌
图7 革兰氏染色后的自选细菌
3.3结果分析
根据革兰氏染色的原理以及观察到的细菌的染色情况可以知道，大肠杆菌被染成红色，
为革兰氏阴性菌；金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌被染成蓝紫色，为革兰氏阳性菌；自选的待测菌种经革兰氏染色后呈现蓝紫色，可知该菌种为革兰氏阳性菌。
3.4思考题
1. 油镜观察时应注意的问题：①在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察， 然后将需进一步放大的部分移到视野的中心；需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。②
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油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。在载玻片和镜头之间加入香柏油的作用：①增加照明亮度 ②增加显微镜的分辨率。
2. 什么是物镜同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
3. 影响显微镜分辨率的因素：最小可分辨距离＝λ/2nsinθ(λ为光源光波波长，n 为介质折射率，θ为物镜镜口角的半数，即取决于物镜的直径和工作距离）
4. 革兰氏染色成功需注意的问题：①一定要选处于活跃期的菌种染色，老龄的 革兰氏阳性菌会被染成红色造成假阴性。②涂片不宜过厚，以免脱色不完全。③控制好脱色时间，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
5. 当用革兰氏染色法对某些菌染色时，如果这种菌本身能够与结晶紫结合的足够紧密，就可以省去媒染的步骤。如果不需要观察革兰氏阴性菌的形态特征，可省略复染的步骤，此时显微镜下的革兰氏阴性菌无色。
6. 老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色造成假阴性，这是因为若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
7. 为什么肺部组织未被染上蓝紫色？ 因为肺部组织细胞没有细胞壁，虽然细胞膜也可附着结晶紫燃料，但在脱色是很容易被洗掉，故不能染色。
参考文献
1. 沈萍 陈向东. 微生物实验[M].4版. 高等教育出版社，2007.40-44及81-84页
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