6实验1-2 蛋白质的性质实验

实验1－2 蛋白质的性质实验（二）

蛋白质的沉淀反应

一、目的和要求：

1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、原理

在水溶液中的蛋白质分子由表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类：

（1）可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质，提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大变化，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中，加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、操作方法： （1）蛋白质的盐析

加5％卵清蛋白溶液2毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀，倒出少量浑浊沉淀，加少量水，是否溶解？为什么？将管内溶液过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，再观察沉淀的再溶解。 （2）重金属离子沉淀蛋白质

取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入3％AgNO 31—2滴，振荡试管，有沉淀生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？注意使用醋酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时不可过量，否则引起沉淀的再溶解，不妨以实验验证之，取一支试管加入约1毫升蛋白质溶液，加入1％CuSO 4观察至有沉淀，再继续加入过量的CuSO 4，观察沉淀消失，当然也可用0.5％的醋酸铅进行验证。

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（3）某些有机酸沉淀蛋白质

取一支试管，加入蛋白质液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。

（4）有机溶剂沉淀蛋白质

取一支试管，加入2毫升蛋白质溶液，再加入2毫升95％乙醇，混匀，观察沉淀的生成。

（5）加热沉淀蛋白质

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态，盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有很大影响，少量盐类促进蛋白质的加热凝固，当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最快速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不凝固，若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。

取5只试管，编号，按下表加入有关试剂，将各管摇匀，观察，然后放入沸水浴中加热10分钟，注意观察比较各管的沉淀生成情况。

四、试剂与材料

（1） 蛋白质溶液：5％卵清蛋白液或鸡蛋清的水溶液（蛋清：水＝1：9） （2） 3％AgNO 3 （3） 95％乙醇 （4） 5％三氯乙酸 （5） 饱和硫酸铵溶液 （6） 硫酸铵结晶粉末 （7） 0.1％醋酸 （8） 10％醋酸

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（9） 饱和NaCl （10）10％NaOH

思考题：

1、为什么鸡蛋清可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂？ 2、如何解释上述实验现象？

实验1－3 酶的抑制剂与激活剂及温度对酶活性的影响

一、目的和要求：

1、加深对酶性质的认识

2、了解酶促反应的激活与抑制，学习检测激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。 二、实验原理：

酶的活性常受到某些物质影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则降低酶的活性，称为抑制剂。

很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性（值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则成为该酶的抑制剂，NaCl 是唾液淀粉酶的激活剂，但NaCl 浓度到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活性）。

酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最大，大多数动物酶的最适温度为37-40℃。植物酶的最适温度为50-60℃。酶对温度的稳定性与其存在形式有关，有些酶的干燥剂，虽加热到100℃，其活性并无明显改变，但在100℃的溶液中却很快的完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

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三、操作方法

1、酶的激活剂与抑制剂

2、温度对酶活力的影响

淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色，紫色，暗色或红色。最简单的糊精遇碘不呈蓝色。麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

取3支试管，编号后按下表加入试剂，摇匀，将2号、3号两试管放入37℃恒温水浴中，1号管放入冰水中，10分钟后取出，（将1号管内液体分为两半）用碘化钾－碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将1号管中剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液检验，结果如何？

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[注]保温时间根据个人唾液淀粉酶活力调整

四、试剂

（1）稀200－500倍的新鲜唾液

（2）0.2％淀粉的0.3％氯化钠溶液，需新鲜配制

（3）碘化钾－碘溶液，20克碘化钾及10克碘溶于100毫升蒸馏水中，用前稀释10倍。

思考题：

1、试说明酶的激活剂与抑制剂实验中，3号管的意义，并推断出Cl ¯和Cu 2各是唾液淀粉酶的激活剂还是抑制剂？

＋

2、什么是酶的最适温度？它是特征常数吗？与哪些因素有关？有何实践意义？ 3、为什么温度会影响酶的活性？

实验1－4 pH 对淀粉酶活性的影响

一、目的和要求：

加深对酶性质的认识，了解几种常见酶的最适pH 值。 二、原理：

酶的活性受环境pH 的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH 范围内才能表现出它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH 值，称为该酶的最适pH 。低于或高于最适pH 时，酶的活性逐渐降低，不同酶的最适pH 不同。酶的最适pH 值，受

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到底物性质和缓冲液性质的影响。唾液淀粉酶的最适pH 约6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH 为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。

三、操作方法

pH 值对酶活性有影响，环境pH 越远离最适pH 值，酶活性越低。唾液淀粉酶能催化水解淀粉为还原性的麦芽糖、单糖。通过3、5－二硝基水杨酸（DNS ）与产物反应成有色物质，有色物质越多，溶液颜色越深，依此颜色的相对深浅可推知酶的相对活性大小。

按下表加入试管相应试剂，调整好保温时间，一般的保温时间为5－10分钟。如果保温5分钟各管反应液加DNS 后颜色过深，则应把唾液淀粉酶再适当稀释至获满意效果为止，测出各管OD 540值，以OD 值为纵坐标，作出一个表征pH －酶活性关系图，并确定在此条件下酶的最适pH 值。

[注]对于保温时间要根据个人唾液淀粉酶活性大小而进行调整，直至各管反应后颜色差异较大，清楚易辨。一般保温约为5－10分钟。

四、仪器与试剂

1、仪器

（1）试管10支

（2）习惯1ml ×5，5ml ×1 （3）电炉

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2、试剂

（1）稀200－500倍的新鲜唾液；

（2）配制pH 分别为5.8；6.2；6.8；7.2；8.0，浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液 （3）底物（淀粉缓冲液），5克可溶性淀粉，加入相应pH 的50ml 缓冲液调成糊状，将次糊状物加到煮沸约500ml 对应pH 的磷酸缓冲液中，继续煮沸1分钟，然后冷却到室温，并用相应pH 的缓冲液稀释至1升。

（4）3、5－二硝基水杨酸盐试剂：①10克硝基水杨酸溶于200毫升2MNaOH ；

②酒石酸钾钠300克溶于大约500ml 水中

① 与②混合，用水配到1升。

思考题：

1、pH 影响试验中，试剂1％NaCl 、2MNaOH ，DNS 各有何作用？ 2、pH 对酶活性有何影响？什么是最适pH ？与哪些因素有关？

实验1－5 维生素C 含量的测定

一、目的和要求

1、学习定量测定维生素C 的原理和方法 2、掌握滴定法的基本操作技术

3、了解常见植物中维生素C 的含量

二、实验原理

维生素C 是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。维生素C 分布广泛，植物的绿色部分及许多水果（桔类、草、山楂、辣椒等）的含量更为丰富。维生素C 具有强还原性。在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化而破坏，在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将燃料2,6－二氯酚靛酚还原成无色的还原型的2,6－二氯酚靛酚。同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。

氧化型的2,6－二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色，因此当用2,6－二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2,6－二氯酚靛酚立即被还原成无色。但溶液中的抗坏血酸一旦被氧化完全时，则滴下的2,6－二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。所以，当溶液从无色变为微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚好全部氧化，此时达到滴定终点。从滴定时的2,6－二氯酚靛酚标准溶液的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。注意：判断终点时当以溶液从无色转变为微红色时作为终点，不要待较长的一段时

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间后由于微红色消失又继续滴定到微红色才判断为终点。滴定到终点后溶液呈微红色，但放置一段时间后微红色又逐渐减弱至完全消失，这是由于被氧化的酸性条件下为红色的氧化型2,6－二氯酚靛酚会被溶液中的其他还原性物质还原而褪色。幸好溶液中的其他还原性物质在酸性条件下与2,6－二氯酚靛酚反应非常慢，以溶液滴定到刚好变微红色时为滴定终点，所受这些还原性物质干扰程度很低，所以抗坏血酸和染料反应的特异性在一定程度上有所提高。

该法简单易行，但有如下缺点：

（1）在生物组织内和组织提取物中，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在。它们同样具有维生素C 的生理作用，但不能将2,6－二氯酚靛酚还原脱色。

（2）生物组织提取物和生物体液中常含有其他还原性物质，其中有些液可以在相同条件下使2,6－二氯酚靛酚还原脱色。

（3）在生物组织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。如果溶液颜色较深，判断终点比较困难。所以在反应混合物中加入1毫升氯仿，根据有机相中出现不褪色的粉红色来判断终点。 三、操作方法

1、样品的处理和提取：称取1.5克新鲜样品，置于研钵中，加2毫升2％草酸（抑制抗坏血酸氧化酶，1％草酸因浓度太低不能达到此效果），研称匀浆，通过漏斗将样品提取液转移到50毫升容量瓶中，残渣再用2％草酸提取2－3次，提取液及残渣一并转入容量瓶。2％草酸总量为35毫升，最后以1％草酸溶液定容。溶液定容时若泡沫过多，可加几滴乙醚消除泡沫再定容，摇匀，过滤，滤液备用。 2、样品的测定 吸取滤液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2,6－二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的粉红色在15秒内不消失为止，记录所用滴定体积。

3、空白测定

在另一50毫升三角瓶中，放入35毫升2％草酸，并用1％草酸定容，摇匀，取此液10毫升，放入另一50毫升三角瓶中，用2,6－二氯酚靛酚滴定至终点，记录染料用量（注：滴定所用2,6－二氯酚靛酚量很少，可以20滴为1毫升计算所用量）

4、结果与计算

X =

(V 1-V 2) ⨯K ⨯V

W ⨯V 3

×100

X ：100克样品所含维生素C 含量（毫克/100克） W ：称取样品重（克）

V 1：滴定样品所用染料毫升数 V 2：滴定空白所用染料毫升数

V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升） V ： 样品提取液稀释之总体积（即50毫升）

K ： 1毫升染料所能氧化维生素C 之毫克数，可由标定算出。

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四、附注

1、2,6－二氯酚靛酚溶液的标定

准确称取维生素C20毫克，用1％草酸溶液定容至200毫升，吸取此溶液10毫升以1％草酸再次稀释定容至200毫升，吸取此液10毫升，放入50毫升三角瓶中（同时吸取10毫升1％草酸于另一50毫升三角瓶中，作空白对照），立即用所要标定的2,6－二氯酚靛酚钠滴定至粉红色出现15秒不消失为止，记录所用毫升数，按下式计算K 值（即1毫升染料所能氧化抗坏血酸的毫克数）。

K =

G 200

⨯10200

⨯10V

式中：G 为称取维生素C 的毫克数

V 为滴定10毫升标准维生素C 时所用去染料液的毫升数与滴定空白所用毫升数之差值。

2、操作要尽可能快，并防止与铁铜器接触，以减少维生素C 的氧化。 3、草酸及样品的提取液避免日光直射。

4、当样品液本身带色时，测定前于提取液中加入1毫升的氯仿或2－3毫升的二氯乙烷。在滴定过程中有机相由无色变成粉红色时，即达终点。 五、实验材料、仪器和试剂 1、实验材料：水果或蔬菜 2、仪器：

（1）微量滴定管，5ml ×1 （2）量瓶 50ml ×2 （3）三角瓶 100ml ×2 （4）研钵

（5）量筒 （6）刻度吸管 10ml ×2 3、试剂

（1）1％草酸：称取5克草酸溶于少量蒸馏水中，定容至500毫升 （2）2％草酸：称取10克草酸溶于少量蒸馏水中，定容至500毫升

（3）0.001N2,6－二氯酚靛酚钠溶液：称取干燥的2,6－二氯酚靛酚钠60毫克，放入200毫升量瓶中，加热蒸馏水100－150毫升，滴加0.01mol/LNaOH4－5滴，强烈摇动10分钟，冷却后加水至刻度。摇匀后过滤，将滤液至于棕色瓶中，贮于冰箱中备用，有效期一周，使用前需标定（见附注）。

思考题：

1、简述维生素C 的主要生理意义

2、本实验的主要误差来源是什么？如何控制？

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实验1－6 双缩脲法测蛋白质含量

一、目的和要求

掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理

蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu

＋

2

形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此可利用此特性进行比色测定蛋白质含量。

在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540－560毫微米下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。

除－CONH －有此反应外，－CONH 2－，－CH 2－，－NH 2－，CS －CS －NH 2等基团都有此反应。 三、操作步骤

1、标准曲线的制作

取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以0号管为空白，在550nm 下测定消光值（OD ），以各管蛋白质含量（毫克）为横坐标，OD 值为纵坐标，画出标准曲线。

2、样品测定：取样品1ml ，同法进行，测其OD 值，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。

四、仪器与试剂 1、仪器：

（1）分光光度计 （2）试管（10支） （3）吸管1ml ×3；5ml ×1

2、试剂：

（1）双缩脲试剂：在930毫升蒸馏水中加入10mol/L的KOH 的溶液10ml 和25％的酒石酸钾钠溶液20ml ，在剧烈搅拌下逐滴加入40ml4％的CuSO 4·5H 2O 溶液，此试剂可长期使用，但要严密贮存，若有沉淀，则应重新配制。

（2）蛋白质标准液：称取纯净的酪蛋白（或牛血清蛋白）1克，溶于0.05mol/LKOH溶液中，定容至100毫升。

（3）未知样品液：可用酪蛋白或其他蛋白质提取液

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实验1－7 粗卵磷脂的制备和检验

一、原理

卵磷脂在脑、神经组织、肚、肾上腺和红细胞中含量较多，蛋黄中含量更是特别多，卵磷脂易溶于醇、醚等脂溶剂，但不溶于丙酮，可利用此特性进行提取和检验。

新提取的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而呈黄褐色。卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥臭味，可据此鉴别。

二、材料和试剂

（1）鸡蛋黄 （2）95％乙醇 （3）10％NaOH

三、实验步骤

1、提取：于小烧杯内置蛋黄约2克，加入约60℃的95％乙醇15ml ，边加边拌，冷却、过滤。若滤液不清，要重滤，直至透明为止。将滤液置于蒸发皿中，蒸汽浴上蒸干，残留物即为卵磷脂。

2、回收率的测定：准确称量所提卵磷脂的重量，与所称蛋黄重量之比，即为回收率。 3、检验：取得到的卵磷脂少许，置于试管中，加10％NaOH 约2ml ，水浴加热（或电炉煮沸），嗅其气味，有何感觉？

4、卵磷脂性质的观察：取得到的卵磷脂少许，置于试管中，加入1ml95％乙醇，观察有何现象产生？再加入1－2ml 丙酮，观察有何现象产生？

思考题：

1、卵磷脂包括哪些物质？各为何成分？试举例说明 2、试解释实验步骤4中出现的现象。

实验1－8 3,5-二硝基水杨酸比色法

一、目的和要求

掌握还原糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖方法，并熟悉分光光度计的使用 二、实验原理

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在NaOH 和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS ）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的范围内，，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

三、仪器及试剂

（1）722型分光光度计 （2）水浴锅 （3）电炉 （4）15mm ×180mm 试管 （5）3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂：称取6.5克DNS 溶于少量蒸馏水中，移入1000ml 容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml ，再加入45克丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml 。

（6）葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg ，加入少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml ，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

四、实验步骤：

1、葡萄糖标准曲线制作

取5支15mm ×180mm 试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

出后再用自来水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml ，摇匀，在540nm 波长处测定光吸收值。以1.0ml 蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg ）为横坐标，以OD 540作为纵坐标，绘制标准曲线。 2、样品中还原糖的提取

将样品（芒果或其他果蔬）置于研钵中分别加入蒸馏水50ml 进行研磨，将匀浆转移至三角瓶中，50℃保温20分钟，使还原糖完全浸出，定容至100ml 容量瓶中，再过滤，取滤液测还原糖。

3、样品中还原糖含量的测定

取三支15mm ×180mm 试管，分别按下表加入试剂：

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然后将样品的光吸收平均值在标准曲线上查出与其相对应的含糖量。

实验1－9 蛋白质的两性反应和等电点的测定

一、目的和要求

1、了解蛋白质的两性解离性质。 2、初步学会测定蛋白质等电点的方法

二、实验原理

蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基、巯基、胍基、咪唑基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样是两性电介质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH 值，称为该蛋白质的等电点（PI ）。当溶液的pH 大于等电点时，即在O H ˉ较多的条件下，蛋白质分子带负电荷，称为阴离子。

蛋白质等电点多接近于pH7.0，略偏酸性的等电点也很多，如自明胶的等电点为pH4.7，也有偏碱性的，如精蛋白等电点为pH10.5－12.0。在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。

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- -

三、实验步骤

（一）蛋白质两性反应

1、取1支试管，加0.5％酪蛋白溶液20滴和0.01溴甲酚绿指示剂5－7滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。

2、用细滴管缓慢加入0.02mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH 接近于酪蛋白的等电点，观察溶液颜色的变化。

3、继续滴入0.02mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明其原因。 3、继续滴入0.02mol/L氢氧化钠溶液，进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。继续滴入0.02mol/L氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化，说明了什么问题？

（二）酪蛋白等电点的测定

1、取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确加入各种试剂。加入每种试剂后应混合均匀。

2、静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以－，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪一个pH 是酪蛋白的等电点。 3、该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，

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实验中应该严格按照定量分析的操作进行。为了保证实验的重复性，或为了进行大批量的测定，可以事先按照上述的比例配置成大量的9中不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确称取4毫升该溶液，再各加入1毫升酶蛋白醋酸钠溶液。

四、仪器及试剂

（1）0.5％酪蛋白溶液（以0.01mol/L氢氧化钠溶液作溶剂） （2）0.01％溴甲酚绿指示剂

（3）酪蛋白醋酸钠溶液：称取酪蛋白0.25克，加蒸馏水20毫升及1.00ml/L氢氧化钠溶液5ml （必须准确）。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1mol/L醋酸5毫升，倒入50毫升容量瓶内，用蒸馏水定容。结果是由酪蛋白溶于0.10mol/L醋酸钠溶液内，酪蛋白浓度为0.5％。

（4）0.02mol/L氢氧化钠溶液 （5）0.02mol/L盐酸溶液 （6）0.10mol/L醋酸溶液

（7）0.01mol/L醋酸溶液 （8）1.00mol/L醋酸溶液

实验2－1 叶绿素a 、b 含量的测定（分光光度法）

一、原理

叶绿素a 、b 在长波方面最大吸收峰分别位于663nm 和645nm 。同时在该波长时，叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert －Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：

D 663＝82.04Ca ＋9.27C b „„„„„„„„„„„„„（1） D 645＝16.75Ca ＋45.6C b „„„„„„„„„„„„„（2）

（1）、（2）式中的D663、D645为叶绿素溶液在波长663nm 和645nm 时的光密度。 Ca 、Cb 为叶绿素a 、b 的浓度，单位为每升克数。

16.75、45.6为叶绿素a 、b 在波长645nm 时的比吸收系数。 解方程式（1）（2），则得：

C A ＝12.7D 663－2.69D 645 „„„„„„„„„„„„„（3）

C B ＝22.9D 645－4.68D 663 „„„„„„„„„„„„„（4）

C T ＝C A ＋C B ＝20.2D 645＋8.02D 663„„„„„„„„„ （5）

此时，C T 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 的浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算a 、b 总叶绿素的浓度。

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二、仪器药品

扭力天平 剪刀 研钵 移液管 漏斗 大试管 丙酮 碳酸钙

石英砂 721型分光光度计（如有其他精密型号的分光光度计则更好） 三、实验步骤 1、提取叶绿素

从植株上选取有代表性的叶片数张，于电子天平上称取0.1g 鲜重，剪碎后置于研钵中，80%丙酮1ml ，碳酸钙少许及适量的石英砂，仔细研磨成匀浆，80%丙酮定容到10ml 。摇匀，过滤在一干净的试管中，此即为叶绿素丙酮溶液，做测定用。 2、测量光密度

取一光径为1cm 的比色杯，注入上述叶绿素丙酮溶液，另以80％丙酮注入同样的比色杯中，作为空白对照，与663nm 和645nm 波长下读取吸光度。

3、结果计算

根据测量得到的光密度D 663 、D 645，代入（3）式计算溶液中叶绿素a 的含量；代入（4）式中计算得到叶绿素b 的含量，代入（5）式计算得到叶绿素总含量。

最后计算叶子样品中叶绿素含量时，需要考虑稀释因子，则得到：

叶绿素a 含量(同mg /g 鲜重重) =CA ⨯

V G V

÷1000

V 为定容体积；

叶绿素b 含量(同mg /g 鲜重重) =CB ⨯叶绿素总含量

÷1000 G V

(同mg /g 鲜重重) =CT ⨯÷1000

G

实验思考题：

1、 叶绿素a 、b 在红光和蓝光区都有一最大吸收峰值，能否用蓝光区的最大吸

收波长进行叶绿素a 、b 的定量分析，为什么？

实验2－2 植物组织中自由水和束缚水含量的测定

一、原理

植物组织中的水分是由被胶粒所固着的束缚水以及不被胶粒所固着的自由水两部分所组成。束缚水不易蒸发和结冰，不能转为溶剂，也不易被夺取。所以当植物组织被浸入较浓的糖溶液中脱水，一定时间后仍未被夺取的水分为束缚水，而被夺

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取的水分作为自由水。自由水的量可根据所加糖夜浓度的降低量来计算。再由植物组织的总含水量减去自由水量，即可求得束缚水量。

植物体内自由水束缚水含量及其比值率与植物的生长及抗性有密切关系。自由水较多时，代谢活动常较强，生长速度也较快，但抗性往往降低。而束缚水含量多时，则情况相反，所以自由水与束缚水含量往往作为植物抗性生理的一个指标。

二、仪器与药剂

（1）阿贝折射仪或糖量计 （2）滤纸 （3）烘箱 （4）称量瓶 6个 （5）天平 1/10000 （6）移液管 5ml 、10ml 、25ml （7）钻孔器 （8）菜心叶片 （9）60％蔗糖溶液

三、实验步骤

1、取铝盒两个，洗净，烘干，称重备用。

2、取待测样品、快速剪碎，分别放于两个已知重量的铝盒重，盖上盖子以免水分蒸发。

3、在天平上称重，记录后，1号盒置于100－105℃烘箱中烘干至恒重，以计算含水量占鲜重的百分数。

4、用5ml 移液管吸取60％的蔗糖5ml ，加入2号盒中摇匀测糖百分数B 1，然后加盖后再在天平上称重，以求得所加糖液重量B ，并摇动盒中溶液，使与样品混和均匀，放于荫凉处30分钟，其间不时摇动。

5、用滴管吸取2号瓶中上层透明的溶液，滴一滴在折射仪棱镜（或糖量计）的毛玻璃上，旋紧棱镜，在20℃下测定此浸出液的含糖百分数B 2及原来糖液的百分数B 1（蔗糖溶液的原始浓度t 必须在折射仪上测得）。

6、计算：按下式计算植物样品中自由水含量％。

β=

B (B 1-B 2) B 2⨯W f

„„„„„„„„„„„„„（1）

式中：β为自由水含量％

B为加入样品中蔗糖溶液重 B1为原蔗糖溶液浓度百分数

B2为加样放置一段时间后糖溶液的浓度百分数 Wf为植物样品鲜重

求得自由水含量％后，即可根据下式求出束缚水含量％ 束缚水含量％＝组织含水量－组织中自由水％

26 - -

实验作业：

测定同一植物不同品种的自由水和束缚水含量，实验重复三次，把结果填入下表：

植物组织自由水和束缚水含量测定记录表

思考题

测定自由水和束缚水含量有何意义？

实验2－3 生长素对根芽生长的不同影响

一、原理

生长素包括植物体内产生的吲哚乙酸及人工合成的化学试剂萘乙酸，2,4－D 等，均有刺激植物生长的作用。如促进细胞的生长与分化，加速根、芽的伸长、促进果实的形成与种子的萌发等。但不同浓度作用不一样，一般来说，在浓度小或者用量少时有刺激生长的作用。在浓度大或者用量过多时，则抑制生长，甚至会导致植物死亡。不同器官和不同位置的组织对生长素的反应也不一样，如刺激芽生长的浓度比刺激根生长的浓度要大些。

二、仪器及试剂

（1）培养皿 （9cm ） （2）移液管 （0.1ml ；10ml ） （3）10ppm 萘乙酸 （4）滤纸（7cm ）

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三、实验步骤

1、洗净、烘干五套培养皿，在皿的边缘贴上标签，分别表明

（1）10ppm ； （2）10ppm （3）10ppm （4）10ppm （5）蒸馏水 2、在（1）皿中用10ml 移液管加入10ppm 萘乙酸溶液10ml 3、在（2）－（5）皿中各加蒸馏水9.9ml

4、用0.1ml 移液管从（1）皿中吸取0.1ml 萘乙酸溶液加入（2）皿充分混匀后，再从（2）皿中吸取0.1ml 加入（3）皿中，如此继续稀释至（4）皿，即成各皿所标志浓度，最后从（4）皿吸出0.1ml 弃去。

5、在每个培养皿中加入洁净的滤纸一张，纸上均匀排放大小相似而发芽一致（刚露白点）的水稻种子10粒，加盖后放在室内。

6、3－5天后，分别测量不同处理中萌发种子根、芽的长度。并将实验所测结果记录于下表，试比较不同浓度的萘乙酸溶液对于水稻幼苗根、芽生长的影响（促进或抑制）

不同浓度萘乙酸对水稻根芽生长的影响

-1

-3

-5

1、水稻种子的萌发：在30℃下浸种2－3天，然后在30℃以下保湿催芽至露白点（约1－2天）。 2、1000ppm 母液的配制：在分析天平上称萘乙酸0.1克用95％酒精少许将其溶解后，倒入100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

3、10ppm 萘乙酸溶液的配制：用移液管吸取母液1ml ，加蒸馏水定容于100ml 容量瓶中。

四、注意事项：

1、生长素浓度要尽量配制准确。 2、试验中要防止生长素污染。 思考题：

在进行生长素实验时，为什么要用NAA 代替IAA ？

28 - -

实验2－4 用CO 2排出法测定呼吸强度

一、原理

植物进行呼吸作用，可通过单位时间内所吸收的O 2或放出的CO 2来测定。本实验是把植物材料置于密闭系统中，用抑制浓度和数量的Ba(OH)2作为植物呼出的CO 2吸收基质，然后再用草酸滴定Ba(OH)2的剩余量，其反应如下：

Ba(OH)2＋CO 2→BaCO 3↓＋H 2O „„„„„„„„„„„„„（1）

Ba(OH)2＋（COOH ）2→B ↓+2H 2O „„„„„„ (2) 同时作一空白对照，二者的差数，例为呼吸作用放出的CO 2量。

二、仪器及试剂

（1）萌发种子或叶片 （2）广口瓶 （3）橡胶瓶塞 （带孔、带钩） （4）纱布、线 （5）小铁钩 （6）0.1mol/L氢氧化钡溶液 （7）0.1mol/L草酸溶液 （8）酚酞指示剂

三、实验步骤：

（一）空白实验：准确地移取25毫升0.05mol/L Ba(OH)2溶液于广口瓶中，随即塞紧瓶塞，充分摇动几分钟，使瓶内CO 2被Ba(OH)2吸收，接着拔去瓶塞上的小橡皮塞，加入1－2滴酚酞指示剂，然后将滴定管插入小孔中，用0.05mol/L（COOH ）2滴定致红色刚退为止，记下草酸的消耗量。

（二）呼吸强度的测定：称取一朵大红花，用线扎住，挂于瓶塞钩上，长度适中，尔后，装入25毫升0.05mol/LBa(OH)2溶液到广口瓶中，放入花，随即塞紧瓶塞，并记录时间，同时摇动瓶子，待40分钟后，取出植物材料再盖紧瓶塞，加入指示剂并用草酸滴定(与空白实验相同) ，记下草酸的消耗量。 四、计算：

呼吸强度（m g /100g 为鲜重∙小时）=(A -B ) ⨯M Ba(OH ) 2⨯44⨯

1W ⨯1T ⨯100

注：A 为对照草酸的消耗量ml 、B 为呼吸瓶草酸的消耗量ml 、44为CO 2时的当量数

W 为呼吸的材料重量（g ）、T 为净呼吸的时间（小时） M 指Ba(OH)2摩尔尔浓度

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实验2－5 不良环境对植物的伤害

一、原理

植物在遭遇到不良环境（如高温、低温等）时，原生质的结构常受到影响，原生质膜的半透性丧失，对物质的透性发生变化，盐类或有机物从细胞中渗出，进入周围环境中。通过电导度的测量和糖的显色反应，可以测知物质的外渗，表明植物受害的程度。

二、仪器及试剂

（1）电导仪 （2）电冰箱 （3）恒温箱 （4）水浴锅 （5）烧杯 （6）量筒

（7）移液管 （8）试管 （9）镊子 （10）2mol/L盐酸溶液

（11）蒽酮试剂：称取1克经过纯化的蒽酮溶解于1000ml 稀硫酸中即得。稀硫酸溶液由760ml 浓硫酸（比重1.84）稀释成1000ml 而成。

三、实验步骤

1、摘取一致性较好的榕树或桉树植物叶片6片，分别以两片为一组，进行如下处理

1）一组置于45℃恒温培养箱中6小时

2）二组置于0－2℃冰箱中6小时

3）三组置于室温下6小时

2、分别对三组叶片用打孔器进行打孔，，取30片圆孔，分别置于三个三角瓶中，加入蒸馏水20毫升，轻摇30分钟，用电导仪测定器电导率。

3、从三个三角瓶中分别吸取0.2ml 渗出液置于三个试管中，每个试管内加入2毫升蒽酮试剂，通过目测比较各试管中颜色深浅，判断三种环境对植物的伤害程度。

4、另对三组叶片进行打孔，各取5片圆孔片分别置于三个试管中，每个试管中加入2ml 盐酸，静置5-10分钟，比较圆孔周围褐色范围的大小，分析三组处理对叶片的伤害程度。

四、思考题

如何通过实验结果比较三组处理对植物的伤害程度的深浅？其原理是什么？

实验2－6 植物叶片光合作用的测定（干重法）

一、原理

一般来说，植物叶片所处的内外因素相同时，它们彼此间光合产量也势必相等，这样在对称的叶片上，假设叶片两边所处条件相同，则两侧的光合产量也相等，因此，先测一半叶的单位面积的干重，待进行一定时间的光合作用后，再测另一半叶30 - -

的单位面积干重，二者之差，加上同时吸收消耗及运出部分的重量，即为该时间内的光合产量。

二、仪器及试剂

（1）小刀或剪刀 （2）黑布袋 （3）纱布 （4）钻孔器 （5）小标签 （6）干燥器

（7）铝盒 （8）胶塞 （9）分析天平 （10）烘箱 （11）5％三氯乙酸

三、实验用品

1、样品的选择：在橡胶树或榕树上选中上部老化叶蓬的中间叶片，所选的叶在实验期间须不受遮荫且光照良好，选妥以后在半片叶上，写明编号（光1、光2、光3）。

2、用三氯乙酸涂叶柄、叶脉；叶柄多涂几次。注意三氯乙酸不要涂到叶肉上。

3、剪取样品：叶柄处理完毕，剪下未编号的半叶，夹于湿纱布中，并在叶片上编号（暗1、暗2、暗3），置于黑布袋中取回。

4、待留在树上的半叶进行6－7小时光合作用后，将其剪下置于黑布袋内取回。

5、称重比较：将光、暗两种叶片，用钻孔器打取小圆片各40片，注意不要打到粗的叶脉。分别将“光”和“暗”两种不同处理了的叶片放入铝盒中，在85℃下烘干5小时，取出，放入干燥器中，冷却后，分别在天平上称重，铝盒和叶片的重量减去铝盒重量，即为叶圆片的重量。

6、注意事项：

（1）选择样片时，要注意生理条件一致，对称性好。

（2）在光合期间保证有阳光照到选取的样本叶片。

四、计算：

真正的光合强度=干重增长(mg)⨯1

时间⨯1

叶面积⨯1.5(mgCO 2/hr /dm ) 2

五、实验作业

记录实验结果并解释之

六、思考题

1、阻碍光合产物外运的方法有哪些？这些方法对测定结果有何影响？为什么？

2、什么是净光合强度？什么是总光合强度？该实验属于哪一类？为什么？

3、目前在实验室内，用于测定光合强度而灵敏度较高的方法有哪些？其原理是什么？（列举2－3种）

4、根据半叶法原理，如果让你设计一个实验来测定植物叶片呼吸强度，该如何进行？（写出简要步骤）

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