植物相关细菌群体感应信号分子的检测

植物相关细菌群体感应信号分子的检测

*刘晓光1, 2, 高克祥2, 高吉刚3

1 江苏大学生命科学研究院 镇江（212013）

2山东农业大学植保学院 泰安（271018）

3 山东农业大学化学与材料科学学院 泰安（271018)

E-mail ：[email protected]

摘 要：许多革蓝氏阴性细菌以种群密度依赖的方式调控基因的表达，这种称为群体感应的调控机制主要基于细菌产生的可扩散的小分子信号物质——酰基高丝氨酸内酯 （AHLs ）。通过组合使用灵敏度不同的系列报告菌株，基于琼脂平板的生物检测及反相C18薄层层析 （TLC ）分析，比较研究了3株植物固氮内生菌Herbaspirillum spp.和2株植物根际促生菌Serratia plymuthica产生AHLs 的模式。结果显示了植物细菌AHLs 的多样性。3株固氮内生菌Herbaspirillum spp.和S. plymuthica菌株IC1270都与小麦根际生防细菌Pseudomonas fluorescens 2-79具有相似的模式， 产生OH-取代基的AHLs 。而2个S. plymuthica 菌株，从葡萄根际分离的IC1270和从油菜根际分离的菌株HRO-C48则产生完全不同类型的AHLs 。 菌株IC1270主要产生OH-取代基的HHHL ，HOHL ， HRO-C48却产生无取代基的BHL , HHL 和优势种O-取代基的OHHL 。由此说明不同属的植物细菌可能具有相似的AHLs 模式；相反，即使生态位相似的同种植物根际细菌S. plymuthica的不同菌株间，却可能产生完全不同类型的AHLs ，似乎与亲缘关系无关。

关键词：Serratia plymuthica；Herbaspirillum spp.; 群体感应系统；酰基高丝氨酸内酯 中图分类号：Q933

1. 引言

在革蓝氏阴性细菌中，有3个重要的基因表达的全局调控系统，即GacA/GacS双因子信号转导系统（GacA/GacS two-component system），胁迫和稳定期的δ因子RpoS ，以及细胞种群密度依赖的Quorum-sensing （QS ）系统。它们控制植物相关细菌的许多表型，如植物生长促进能力、致病性、次生代谢物的产生、生物膜形成以及蛋白和酶的分泌等[1]。酰基高丝氨酸内脂N-acyl homoserine lactones（AHLs/acyl-HSLs）是许多革兰氏阴性细菌都产生的群体感应信号分子，它作为自身诱导物（autoinducer ）在革蓝氏阴性细菌中介导以种群密度依赖和生长发育阶段(指数生长后期和稳定期) 依赖方式的基因表达调控。植物相关细菌的QS 系统调控微生物种群之间以及与寄主植物之间的相互作用，包括共生、致病性、抗生素及胞外酶的产生等特性，因此在农业、医学、环境保护等领域具有广阔的应用前景。而且AHLs 在自然界中作为全局调控的信号分子，通常是在GacA/GacS两组分信号转导系统的控制之下。许多研究已证实这3个全局调控系统之间存在着密切联系，交互作用（cross-talk ）。尽管有些结果相互矛盾，依然可以推测这种调控的级联反应在细菌中可能是一个普遍的现象

[2, 3]。

本文通过组合使用多种系列灵敏度不同的AHLs 信号分子的报告菌株或质粒，以植物根 基金项目：本课题受国家自然科学基金（项目编号：30370954，30670030）资助

际生防细菌Serratia plymuthica 菌株IC1270[4]和HRO-C48[5]，以及3种具有固氮作用的禾本科植物内生细菌Herbaspirillum spp.[6-9]为供试菌株，初步研究并比较分析了不同类型的植物相关细菌产生AHLs 信号分子的模式，为进一步阐明QS 系统全局调控细菌和寄主植物互作的机制奠定基础，可为通过遗传操纵QS 信号通路改善植物与生防或固氮细菌菌株的有益互作开辟新途径。

2. 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和培养条件 本研究所使用的细菌菌株和质粒见表1。液体或固体的LB/LA (Luria-Bertani broth and agar) 用于细菌的培养。报告菌株和供试菌株分别于30℃或37℃振荡培养（140 rpm）至对数生长后期。

2.1.2抗生素 本实验所用抗生素的工作浓度：氨苄青霉素(Amp)， 100µg/ml；利福平(Rif)，40µg/ml ；庆大霉素(Gm)，30µg/ml；四环素(Tc)，20µg/ml。购于Sigma 公司。

表1 供试菌株和质粒

Tab1. Strains and plasmids used in this study

Strain or plamid Relevant characteristics* Reference or source

Agrobacterium tumefaciens NTL4/pZLR4 Gmr Cbr ; β-galactosidase induction-based acyl-HSL bioreporter 11 Chromobacterium violaceum CV026 Violacein production-based acyl-HSL bioreporter 12 Escherichia coli F - endA1 hsdR17 (rK _ mK +) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1

DH5α Φ80d lacZ ∆M15 λ- 13 S17-1(λ-pir) thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Tcr ::Mu) (Kmr ::Tn7) 13 Pseudomonas fluorescens 2-79 phenazine+ production of 3-hydroxy acyl-HSLs 14 Serratia plymuthica

isolated from rhizosphere of grape in Uzbekistan 4 IC1270 Rifr ,

isolated from rhizosphere of oil rape in Germany 5 HRO-C48 Rif r ,

Herbaspirillum seropedicae 7 Herbaspirillum frisingense 8 Herbaspirillum rubrisubalbicans 9 Plasmids

pSB401 Tcr , lux -based acyl-HSL bioreporter 15 pSB536 Ampr , lux -based acyl-HSL bioreporter 15 pSB1075 Amp r , lux -based acyl-HSL bioreporter 15 * Amp r , ampicillin resistance; Gmr , gentamicin resistance; Tcr , tetracycline resistance; Rif r , rifampicin resistance.

2.2 方法

2.2.1 培养上清液中萃取AHLs 信号分子：50 ml待测菌株的过夜培养物，通过离心除去细菌菌体，上清液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，加入无水硫酸钠，过滤后通过旋转蒸发干燥, 回溶于1.5ml 乙酸乙酯中。进一步通过真空旋转蒸发浓缩，最终残余物溶解于50µl 乙腈中，于-20℃冰箱中保存，用于基于琼脂平板的生物检测和TLC 分析。

2.2.2 基于琼脂平板的AHLs 生物检测：不同的报告质粒或菌株对检测不同类型取代基以及

碳链长度的AHLs 信号分子的灵敏度不同[2]，本实验组合使用以下系列的报告质粒和菌株几乎可检测所有侧链长度和不同取代基的AHLs 信号分子。参照文献[10]的方法，在已制备好的琼脂平板上，铺一层与不同报告菌株混合的0.6%的软琼脂，凝固后打孔（5mm ），孔内注入待测样品，并以合成的多种AHLs 标准样品（Sigma ）为对照。30℃恒温箱中孵育数小时或过夜培养，观察结果并拍摄照片。

应用报告质粒（pSB401, pSB536, pSB1075）分析检测上述AHLs 提取物的生物发光（lux -based ）能力，发射的光线通过CL-BIS 发光仪 (DNR Imaging Systems Ltd.)监测。

报告菌株Chromobacterium violaceum CV026产紫色素分析由样品孔周围细菌菌苔产生的深篮紫色的色素指示AHLs 信号分子的产生；报告菌株Agrobacterium tumefaciens NTL4/pZLR4在X-Gal (40µg/ml) 存在时诱导β-半乳糖苷酶的产色分析参考文献[7]的方法，样品孔周围扩散的蓝色区带指示AHLs 信号分子的产生。

2.2.3 AHLs 信号分子的TLC 分析[11]：通常取5µl 的乙酸乙酯提取液点样于RP18，F 254S 反相TLC 平板（德国Merck ），展开剂为甲醇：水（60：40，vol/vol）。约4h 充分展开后，溶剂被蒸发，干燥的TLC 平板用混有不同报告菌株的软琼脂（0.6% agar）覆盖。琼脂凝固后，至于密闭的塑料容器中30℃恒温箱中孵育数小时或过夜培养，观察结果并拍摄照片。以合成的AHLs 标样作对照。

3. 结果与分析

3.1 S. plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp. 菌株AHLs 的检测分析

3.1.1琼脂平板检测结果：使用产生蓝色斑点的报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4（图1A ）和生物发光的报告质粒pSB401（图1B ）时，菌株IC1270都表现阳性反应；而产紫色素的报告菌株Chromobacterium violaceum CV026和报告质粒pSB536, pSB1075都不能检测到菌株IC1270 AHLs 信号分子的产生，表现阴性反应。也说明菌株IC1270不产生长链的信号分子（≥C 10-HSLs ）和短链的BHL(N-butanoyl-L-HSL)。而使用报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4时，3个Herbaspirillum spp. 菌株样品孔周围都产生蓝色区带，表现阳性反应（图1A ），产生AHLs 。

图１ 在琼脂平板上检测S. plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp. 产生的AHLs 信号分子

Fig 1 Detection of AHLs produced by S. plymuthica IC1270 and Herbaspirillum spp. on agar-plates with A.

tumefaciens NTL4/pZLR4 reporter (A) and pSB401 lux reporter (B)

OHHL: standard; IC1270: S. plymuthica IC1270; H1: H.seropedicae ; H2: H. frisingense; H3: H. rubrisubalbicans

3．1．2 AHLs 信号分子的TLC 分析：经TLC 分离后，使用混有报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4和x-gal 的软琼脂铺平板，与标准样品比较，并以生防菌P. fluorescens 2-79的AHLs （Lane 6）为参照[14]，结果显示S. plymuthica菌株IC1270产生至少3种可检测水平的羟基取代基的HHHL(N-3-hydroxy-hexanoyl-L-HSL)和HOHL(N-3-hydroxy-octanoyl-L-HSL)及1种未知的信号分子； 而3个Herbaspirillum spp. 菌株产生2种可检测水平的羟基取代基的HHHL （R f =0.56）和HOHL( Rf =0.30)。由图2可见，5个供试菌株产生的AHLs 信号与已知生防菌株P. fluorescens 2-79具有相似的模式，属于C-3位置为羟基（OH-）取代基的AHLs 。

图2 S. plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp. AHLs信号分子的TLC 平板分析

Fig.2 TLC assay with NTL4/pZLR4 overlay in strains S. plymuthica IC1270 and Herbaspirillum spp.

1- mixture of HHHL (10µg. ml-1, 8µl ) and HOHL (1µg. ml-1, 5µl ) standards; 2- ethyl acetate extract of strain IC1270 (20µl); 3, 4, 5- ethyl acetate extracts of strains H.seropedicae, H. frisingense and H. rubrisubalbicans

respectively (5µl) ; 6- ethyl acetate extract of strain P. fluorescens 2-79( 5µl ).

3.2 S. plymuthica HRO-C48 AHLs信号分子的检测分析

3.2.1琼脂平板检测结果：使用产生蓝色斑点的报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4，产紫色素的报告菌株C. violaceum CV026（图3A ）以及对短链AHLs 敏感的生物发光的报告质粒pSB536（图3B ），菌株HRO-C48均表现阳性反应，并产生很强的AHLs 信号。

图3 在琼脂平板上检测菌株HRO-C48 产生的AHLs 信号分子 Fig. 3 Detection of AHLs produced by S. plymuthica HRO-C48 on agar- plates with C. violaceum CV026 reporter (3A) and pSB536 lux reporter (3B). C48: S. plymuthica HRO-C48; BHL: standard; CK: negative (3A) or positive

(3B) control.

3.2.2 菌株HRO-C48 AHLs信号分子的TLC 分析：经TLC 分离后，通过组合使用不同系列的报告菌株和质粒系统，表明菌株HRO-C48产生至少3种可检测水平的AHLs 信号分子, 包括拖

(N-hexanoyl-HSL), 尾的斑点 OHHL(N-3-oxo- hexanoyl-HSL, Rf =0.53)（图4A 圆形斑点 HHL

R f =0.38(图4A) 和 BHL(N-butanoyl-HSL,Rf =0.6)（图4B ），而且以OHHL 为优势种。但报告质粒pSB1075表现阴性，说明菌株HRO-C48也不产生长链的信号分子。

图4 菌株HRO-C48 AHLs信号分子的TLC 平板分析

Fig. 4 TLC assay for AHLs by strain HRO-C48

A: with C. violaceum CV026 overlay. Lane 1- mixture of BHL (100µg. ml-1, 5µl ) and HHL (10µg. ml-1, 5µl) standards; Lane 2- OHHL (10µg. ml -1, 7µl) standard; Lane 3- ethyl acetate extracts of strain HRO-C48 (diluted 10-fold , 2 µl). B: with pSB536 lux reporter. Lane 1- BHL (100µg. ml-1, 5µl) standard; Lane2- ethyl acetate

extracts of strain HRO-C48, 5µl. 4. 结论和讨论

多数革蓝氏阴性细菌产生的QS 信号分子属于 AHLs，其专化性由酰基侧链的长度

（C 4-C 12）及C-3 位置取代基的性质所决定, 包括3-oxo- HSLs（氧取代基）, 3-hydroxy -HSLs（羟基取代基）和 alkanoyl-HSLs（无取代基）3组。不同的报告菌株系统对不同类型的 AHLs 敏感性不同，所以要全面系统地检测和鉴定植物细菌产生的 AHLs ，必须组合使用几种不同的报告系统。例如本实验所使用的3个检测系统中，报告菌株 A. tumefaciens NTL4/pZLR4 具广谱性和单个菌株最大的灵敏度，可有效检测3组不同类型取代基的AHLs ，但却不能检测短链的BHL (N-butanoyl-HSL)，有其局限性；而报告菌株C. violaceum CV026 则对短链和中等长度侧链的 alkanoyl-HSLs 型信号分子敏感，易于检测BHL ，但对长链的 alkanoyl-HSLs 及 多数 3-oxo-HSLs 缺乏敏感性；基于lux 的3个生物发光的报告菌株中，pSB536对短链的BHL 敏感，pSB1075 对长链的AHLs 敏感，而pSB401则对OHHL 较敏感。所以不同报告系统可以相互补充[10,11]。

琼脂平板法检测2个S. plymuthica和3个Herbaspirillum spp.供试菌株，都呈阳性反应，表明5个菌株都能产生AHLs 。经TLC 平板分离，并通过比较不同标准样品的Rf 值和斑点的形状，初步鉴定，3个Herbaspirillum spp. 菌株和S. plymuthica IC1270都产生与小麦根际分离的生防菌P. fluorescens 2-79 相似的OH-取代基的AHLs ，尽管不同属；而S. plymuthica HRO-C48则产生完全不同类型的AHLs 信号分子，包括无取代基的BHL 和HHL ，并以O-取代基的OHHL 为优势种。而且菌株HRO-C48产生很强的信号，使用C. violaceum CV026作为报告菌株时，至少稀释 20倍 才能在TLC 平板上得到很好的分离结果。但也因为稀释的作用，未能检测到BHL 。通过对BHL 敏感的报告质粒pSB536，弥补了这一缺陷，证明了BHL 的存在。同时我们的前期研究结果已证实在菌株IC1270 QS系统 AHLs 信号分子的产生受 GacA/GacS 双

这些都为研究QS 全局调控生防相关表型的机制及其不同调控系统因子系统的调控的假说[1]。

间的互作奠定了基础。

Herbaspirillum spp. 属于禾本科植物内生菌，具有固氮作用，从而促进植物生长。并与S. plymuthica IC1270 和P. fluorescens 2-79具有相似的AHLs 模式。S. plymuthica IC1270分离于乌兹别克斯坦的葡萄根际，菌株HRO-C48

则分离于德国的油菜根际，都是植物根际促生菌，

居于相似的生态位，属于同一物种，并具有相似的生防机制，主要通过产几丁质酶和抗生素硝吡珞菌素pyrrolnitrin （Prn ）参与生防活动（关于HRO-C48菌株产Prn 是我们新发现尚未发

但却产生强度和取代基完全不同的AHLs 表的数据）；通过产吲哚乙酸IAA 促进植物生长[3,4]。

信号分子，我们已经克隆和注册了菌株HRO-C48编码 AHLs 的合成酶及反应调控基因

splI/splR (Genbank accession number: AY841161)，希望通过克隆菌株IC1270的luxIR 类似基因和序列比较研究，从分子水平阐明2个S. plymuthica 菌株产生如此不同的AHLs 信号分子的机制。

5个供试菌株都检测到AHLs ，分属于O-取代基、OH-取代基及无-取代基3组类型，具有丰富的多样性，但与其各自所属的分类地位并无必然联系。这些信号分子属于单一的QS 系统，还是由不同的QS 系统控制有待于进一步研究。

5. 致谢

通讯作者特别感谢国家留学基金委(CSC)的资助及Chernin Leonid教授慷慨提供菌株。

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Detection of N-acyl-homoserine lactone signal molecules in

plant-associated bacteria

Liu Xiaoguang 1, 2, Gao Kexiang 2, Gao Jigang 3

1 Ins titute of Life Sciences, Jiangsu University Zhenjiang, 212013

2 College of Plant Protection, Shandong Agricultural University Taian, 271018

3 College of Chemistry and Material Science, Shandong Agricultural University Taian, 271018

Abstract

Many gram-negative bacteria regulate gene expression in response to their population density. This regulatory mechanism, called quorum-sensing (QS) is mainly based on the production of small, diffusible N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs or acyl-HSLs) signal molecules by the bacteria. Using combination of a sets of bioreporters, we comparatively assayed and detected the AHLs patterns of quorum-sensing signal molecules produced by plant growth-promoting rhizobacteria Serratia plymuthica strains IC1270 and HRO-C48, as well as the endophytes Herbaspirillum spp. which have capability of fixing nitrogen through both agar plate-based bioassay and thin-layer chromatography (TLC) analysis. Results showed that all five strains produced AHLs and possessed abundant diversity. Herbaspirillum spp. and S. plymuthica IC1270 produced acyl-HSLs with 3-hydroxy substitution, displayed similar pattern to the wheat rhizosphere biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2-79, mainly producing HHHL (N-3-hydroxy-hexanoyl-HSL), HOHL ( N-3-hydroxy-octanoyl-HSL), although they are belong to different genera. In contrast, S. plymuthica strain HRO-C48 produced completely different types of BHL and HHL (non substitution ), as well as the dominant species of OHHL with 3-oxo substitution. Although strains IC1270 and HRO-C48 isolated from grape and oil rape rhizosphere respectively are in similar nich and belong to the same genus. It implied that AHLs pattern of plant associated bacteria has no close correlation with their relations in taxon.

Keywords: Serratia plymuthica; Herbaspirillum spp.; Quorum-sensing; N-acyl-homoserine lactones. *