草鱼病毒性出血病研究进展
第２卷第３期
２００
南方水产
Ｖ０１．２．Ｎｏ．３
６年６月
ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ
Ｊｕｎ．．２００６
・综述・
草鱼病毒性出血病研究进展
王方华，李安兴
（中山大学生命科学学院，广东广州５１０２７５）
摘要：草鱼出血病是严重困扰着草鱼养殖业发展的一大疾病。根据近几十年来对于该病研究的进展，就草鱼出血病病原的生物学特性、不同发现株之间的比较、分子生物学研究以及疾病的防治等方面进行综合评述，总结了草鱼出血病的研究现状及研究中亟待解决的问题，并提出了该领域以后的重点研究方向。为进一步深入开展对该病的防治研究提供参考，以提高草鱼养殖的生产率。关键词：草鱼出血病；呼肠孤病毒；分子生物学；病害防治
中图分类号：ｓ９４１．４１＋ｌ
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７３—２２２７一（２００６）０３—００６６—０６
ＡｄＶａｎｃｅｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｆ
ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐ
ＷＡＮＧＦａｎｇｈｕａ，Ｕ
Ａｎｘｉｎｇ
（７％＆＾ｏＤｚ矿￡谵＆ｉｅｗｅ，Ｓｕ凡拖ｔ－Ｓｅｎ踟妇巧蚵，‰，动ＤＨ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｒａｓｓｃａｒｐｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｉｓ
ｈａｓ
ａｓｅｖｅｒｅ
５１０２７５，现ｉ船）
ｄｉｓｅａｓｅｍａｔａｆｆｅｃｔｔｌｌｅ挚ａｓｓｃａｒｐｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｉｎｔｌｌｅｐａｓｔｓｅｖｅｒａｌ
ｄｅｃａｄｅｓ，ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｂｅｅｎｍａｄｅｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｇｒａｓｓｃａｒｐｈｅｍｏⅡｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｉｎＣｈｉｎ＆ＴｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔａｄｖａｎｃｅｓａｂｏｕｔＧＣＲＶｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｂｉｏ—
ａｄｖａＪｌｃｅ，ｔＩｌｅ
ｃｕｒｒｅｎｔ
ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｕｌｔｒａ－ｓｔｎｌｃｔｕｒ壬ｌｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＧＣＲＶ，ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｔｒｏｌ
ｓｔｍｔｅ舀ｅｓ
ｏｎ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ
ｔｏ
ｏｆＧＣＲＶ．
Ｈｅｒｅｗｅｒｅｖｉｅｗｔｈｅｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｐｕｔｆｏｒｗａｒｄｔｈｅｑｕｅｓｔｉｏｎｓ
ｗｅ
ｓｈｏｕｌｄｒｅｓｏｌｖｅｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ，ｈｏｐｉｎｇ
ｅｎｈａｎｃｅｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆ铲ａｓｓｃａｒｐｂｒｅｅｄｉｎ昏
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｏｆｇｒａｓｓｃａ】ｐ；Ａｑｕａｒｅｏｖｉｒｕｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ；ｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
草鱼（Ｄｅ，唧＾ｎ甲印如ｎ
ｉ如ｚｚ獬ｃ
ｅｔ
Ｖ）是一种草食性
１
鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的２０％。但草鱼病害多，而其中以草鱼出血病最甚，给养殖业带来巨大的损失…，因此草鱼出血病是我国水产研究中的一个重要课题。近十年来，随着现代分子生物学技术在鱼类病毒研究领域的广泛应用，中国的科技工作者对草鱼出血病病毒的研究和认识也愈来愈深入，取得了很多突破性的进展，进一步加深了人们对于该病的认识。本文对此进行综合评述，以期为进一步深入开展对于该病的防治研究提供参考。
草鱼出血病的流行病学和病原研究
草鱼出血病流行于湖北、广东、广西、江西、江苏、
浙江、福建、上海、河南、河北、四川等省、市、自治区的主要养鱼地区。病鱼的主要症状是口腔、上下颁、头顶部、眼眶周围、鳃盖、鳃及鳍条基部充血，有时眼球突出；
剥除鱼的皮肤，可见肌肉呈点状或块状充血、出血，严重
时全身肌肉呈鲜红色；肠壁充血，但仍有韧性，肠内无食
物；肠系膜、周围脂肪、鳔、胆囊、肝、脾、肾也有出血点或血丝，故以症状定名为草鱼出血症。根据出血部位的不同可将该病的症状分为３种类型：红肌肉型、红鳍红鳃
收稿日期：２００６旬１讲；修回日期：２００６＿０１—１０
作者简介：王方华（１９８２一），男，硕士研究生，从事水生经济动物病原分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｄｚｂｗｆｌｌ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：李安兴，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｓ５８＠ｚｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
万方数据 万方数据
第３期王方华等：草鱼病毒性出血病研究进展
６７
盖型和肠炎型。
‘草鱼出血病的发病季节长，每年６月下旬至９月底是主要流行季节，高峰在８月，在水温２５—３０℃最为流行，死亡率高，高密度饲养的鱼种池危害更甚，常发生养殖的草鱼全军覆没。人工感染健康草鱼，从感染到发病死亡约
需４～１５ｄ，一般７～１０ｄ，其病程有潜伏期、前趋期和发展期３个阶段。
早在１９５３年，倪达书等旧１就注意到具有出血症状的草鱼病鱼。１９５４年秋开始怀疑它可能是一种病毒性疾病。陈燕橥等用分离病毒的方法从病鱼组织得到的滤液感染草鱼，获得典型的出血症状并能在单层细胞中传代繁殖，才正式
确定草鱼出血病是由病毒引起。其根据病毒的形态和理化特性，将其定名为草鱼呼肠孤病毒（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ
ｏｆ，ｇｒａｓｓｃａｒｐ
ＧｃＲＶ），该病毒隶属水生呼肠孤病毒属（Ａｇ№陀伽ｉ而ｄ凹），是中国分离的第一种鱼类病毒‘３１。ＧｃＲＶ除能感染草鱼外，还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条和鲢等，并能使这几种鱼发生出血病症状而死亡，尤其是稀有绚鲫死亡率高达１００％。电镜观察患病鱼的组织切片发现，在其肝脏、心脏、肌肉、。肾脏、脾、鳃和肠道内都发现有病毒粒子的存在。另外，毛树坚等…曾报道了从出血病病鱼组织的电镜研究中发现了２种病毒颗粒，一种是呼肠孤病毒，另一种
是２０～３０ｎｍ大小的病毒。经病毒的核酸分析，前者是双
股ＲＮＡ病毒，后者为单股ＲＮＡ病毒，并且用这２种病毒
分别感染健康草鱼，可导致不同的发病症状：呼肠孤病毒主要导致“肠出血型症状”，另一种病毒（经初步鉴定属于小ＲＮＡ病毒科）主要导致“肌肉出血型”出血病。此
结果同时也初步解释了出现不同症状出血病的原因。但关于草鱼小ＲＮＡ病毒导致草鱼出血病的病理机制以及病原和
病症的关系，未见有进一步的报道。
２呼肠孤病毒的生物学特性研究进展２．１病毒结构研究
近年来，随着低温电镜技术和计算机三维重构方法的
逐步应用，对于病毒的三维结构更精细的研究工作正逐步展开，最近方勤等”１对该病毒分辨率达到１７埃的三维重构与衣壳蛋白特性研究。结果表明：ＧｃＲＶ颗粒呈多层排列，包括ＲＮＡ核心与内壳层、中间层与外壳层。由２００个按Ｔ＝１３对称排列的三聚体构成外衣壳。其典型特征是在５次轴上出现三聚体缺失凹陷区，暴露出中间层三聚体亚单位，内壳层由１２０个单体构成，按Ｔ＝１排列。结构特点与呼肠孤病毒科成员内衣壳特征相一致。通过对纯化的ＧｃＲＶ完整颗粒进行电泳分析，揭示成熟的病毒含有７种衣壳蛋白组分（ＶＰｌ～ＶＰ７）。分子量在３４～１３８ｋＤａ之间。
２．２
ＧＣＲＶ的理化特性研究
ＧＣＲＶ主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量的糖类，
万 万方数据
方数据以糖蛋白的形式存在，不含脂类。５１。ＧｃＲＶ对温度（５６℃）有一定的稳定性，但反复冻融会对病毒感染力有较大影响，病毒对氯仿、乙醚等有机溶剂有一定的抗性，对酸（ｐＨ＝３）、碱（ｐＨ＝１０）处理不敏感，完整病毒在氯化铯中的浮
力密度约１．３６ｇ・ｍＬ～。在蔗糖中浮力密度为１．３０５
ｇ・ｍ～，
另外，用胰蛋白酶或精氨酸处理ＧｃＲＶ，病毒滴度都略有
上升：引。
２．３细胞培养和感染特性
ＧｃＲＶ能感染培养细胞并增殖和传代，产生合胞体状细胞病变效应（ｃＰＥ）。现已建立起多株对ＧｃＲＶ敏感的细
胞系。７Ｊ。病毒复制部位在胞浆，能形成晶格状排列，在体外细胞培养中最佳增殖温度为２８℃，一般感染１２ｈ后即开始增殖，２４～７２ｈ大量增殖，使细胞产生典型的病理变化（ｃＰＥ），形成直径约为２ｍｍ的空斑哺１。５ｄ左右达到最大
增殖，此时病毒的滴度最高，以后逐渐平缓。关于病毒的致病机理、宿主范围及病毒的检测曾有系统的综述【９。１“。
３
不同地区分离株的比较研究
目前已经报道了许多对于该病的分离株，并对各分离
株的特性分别进行了研究报道¨２。１…，但对于各分离株之间的差异比较尚未见有系统的报道。而就相关的分离株进行
比较研究，有助于认识该病毒的遗传差异与进化、病毒的区系分布等，为进一步构建该病毒的系统进化树提供参考。同时通过比较各分离株免疫原性的差异，找出不同分离株抗原蛋白或基因之间的差别，可为下一步亚单位疫苗和基因疫苗的制作提供一些依据，从而能制备出保护率更高的并能对所有ＧｃＲＶ病毒分离株进行免疫保护的疫苗，解决目前一种疫苗不能保护鱼抵抗所有分离毒株的难题。因此
对不同地区分离株的比较有较大的实际意义，应加大对这
方面的研究力度，弥补在该病毒研究中的空缺。
３．１不同毒株之间核酸分子量的比较
各毒株之间核酸分子量比较见表１。从表中可以看出，ＧｃＲＶ不同分离株其基因组都由１１个ｄｓＲＮＡ片段组成，不同的毒株之间，病毒基因组的总分子量差异不大，而各片段分子量有所差异¨４川。这一点从它们的基因组ＰＡＧＥ图谱中也可反映出来‘１…。而对于这些不同毒株间基因组序列比对的研究可作为描述水生呼肠孤病毒属不同成员多样性的一个标准。另外进一步探讨这些不同基因片段所编码的蛋白之间的差异，可以为进一步弄清组成该病毒结构的不同蛋白及其所执行的功能差异奠定基础。
３．２不同病毒株细胞感染特性和致病性的比较
现已建立起多株对ＧｃＲＶ敏感的细胞株（系），但不同分离株对细胞株的感染性方面存在一定的差别。李军
等¨纠比较了ＧｃＲＶ８６１和ＧｃＲＶ８７３２毒株的组织培养特性，
６８
南方水产第２卷
发现ＧｃＲＶ８７３株感染草鱼肾脏组织ＣＩＫ和ＧＣＫ细胞，进行了ＧｃＲＶ各基因片段的序列分析。该成果将为ＧｃＲＶ
以后的同源性比较、进化研究及各基因片段所编码的蛋白质结构与功能研究奠定良好的基础。
４．２
２８℃培养３～４ｄ后，培养细胞大部分裂解，出现典型的细
胞病变效应（ｃＰＥ），而ＧｃＲＶ８６１株感染ｃＩＫ和ＧｃＫ细
胞，连续传至ｌＯ代也未见明显的ｃＰＥ。另外，在研究中还发现，ＧｃＲＶ感染细胞的能力与其感染鱼体的毒力并不都
是一致的，ＧｃＲＶ８７３对培养细胞感染力强，但对鱼体的毒
ＧＣＲＶ体内与体外转录和翻译研究
ＧＣＲＶ基因组的转录和翻译过程都是在宿主细胞质中
完成的，病毒核酸可穿过核心上的中空钉状物释放到宿主细胞的细胞质中。近年来的研究表明：ＧｃＲＶ核心内含有
力却较弱。而ＧｃＲＶ８６１株则恰相反‘”’”“１。方勤等‘２１１对低温保存的３株草鱼呼肠孤病毒ＧｃＲＶ８７３、ＧｃＲＶ８７５、
ｃｃＲＶ８７６与新分离的ＧｃＲＶ９９ｌ毒株进行了细胞培养与病毒感染特性的研究。结果发现，低温保存的前３株病毒株在
ＲＮＡ转录酶，可催化ｄｓＲＮＡ中的一条链转录合成ｍＲＮＡ，该酶的最适酶活温度是２８℃，且能保持较长的反应时间ⅢＪ。在体外转录条件下，双链ＲＮＡ各节段是全长转录，各节段长度成反比，并且ＲＮＡ聚合酶需要低离子浓度活
化，ＧｃＲＶ转录酶的上述特征，有别于呼肠孤病毒科的其
长时间保存后其滴度有所降低，但仍有一定感染性。经传
代培养后，毒力逐渐升高并趋于稳定，并有结果表明不同
地区分离株病毒的细胞感染特性是有所不同的，其中湖南
地区分离的８７３、９９１毒株感染特性最强。这一结果与湖南
它成员，这是由于它们各自所适应不同的宿主结构的缘故。张保焰和柯丽华他纠研究还发现，ＧｃＲＶ基因组的体内转录
分为早晚２期，早期转录是在病毒感染细胞后４ｈ开始的，
８
地区高的发病死亡率也是相吻合的。
ｈ后开始晚期转录，转录产物ｍＲＮＡ的大小和数目大体上
４病毒的分子生物学研究进展
４．１病毒基因克隆与文库构建研究
自１９８３年首次分离ＧｃＲＶ以来，迄今已有十多年的历史。由于ＧｃＲＶ含ｌｌ条双链分段ＲＮＡ基因组以及其３７端
与病毒基因组的一致。早期转录是ＲＮＡ转录酶以初始感染的病毒ｄｓＲＮＡ为模板进行的转录；晚期转录则是以子代病毒基因组为模板进行的转录，二者没有本质上的差别，只
是转录模板的来源不同。
方勤等Ⅲ１进行了该病毒ＲＮＡ聚合酶基因保守区重组子（ＧｃＲＶ－ＲｄＲｐ）功能区序列在原核细胞中的表达研究，
并得到高效表达的融合蛋白，最近又在此基础上继续对该
不含ｐｏｌｙ（Ａ）尾的特性，使得其基因组文库的构建具有一定的难度及复杂性。虽然目前最为普遍的ｃＤＮＡ文库构建多采用ＲＴ—ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ，但该方法均需借助计算机数据库进行相关种属序列的同源性及保守区域的分析，以获得ＲＴ．ＰＣＲ的引物序列，从而构建同类病毒新毒株的ｃＤＮＡ文库。由于ＧｃＲＶ为呼肠孤病毒科新属新种，在无法进行同源序列比较的情况下，采用随机引物法引导ｃＤＮＡ合成不失为一种简单、可行的策略。ＬＩ等。２引用此方法，通过ＰｃＲ扩增得到了ＧｃＲＶ８６１株第６、９节段部分序列。方勤等‘２
３ｊ
聚合酶基因含保守区的５’与３’末端序列进行了体外表达与纯化研究，由此构建了含保守区ＧｃＲＶＲＮＡ聚合酶的Ｎ端与ｃ端部分基因的重组表达质粒，以确定该基因在原核细
胞的表达水平及表达产物的生物学特性。根据对该酶的功
能研究发现，在ＲＮＡ病毒复制周期的转录调节与翻译中，５’与３’末端序列对于双链ＲＮＡ解旋与单链ＲＮＡ模板的结合才是至关重要的拉“。上述研究结果为ＧＣＲＶＲＮＡ聚合酶特性分析提供了依据，并为进一步酶特性测定与特性分析奠
定了基础。
在原有随机引物法的基础上，通过进行一系列条件比较，
采用微克级模板，成功地构建了ＧｃＲＶ－ＲＮＡ
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｍ６、Ｓ７、Ｓ９、ｓ１０、Ｓ１１的ｃＤＮＡ文库。并用所构建的文库
万
方数据 万方数据
目前，尚未见到关于ＧｃＲＶ体内翻译的报道。但是对
第３期王方华等：草鱼病毒性出血病研究进展
于ＧｃＲＶ在体外翻译的研究结果表明：草鱼出血病病毒ｄｓＲＮＡ的一条链具有ｍＲＮＡ的性质，可在体外进行翻译，其翻译产物为１１条多肽链，与病毒的结构多肽是一致的，只是片段ｓ２、ｓ３、Ｓ５编码的多肽与病毒衣壳中的结构多肽在分子量上有所差异∽…。推测这些体外翻译产物可能为结
构多肽的非成熟中问产物，在宿主细胞内装配过程中还需要进一步的修饰加工。
４．３病毒基因组结构研究
草鱼呼肠孤病毒（Ｇｒａｓｓ
ｃａｒｐ
ｒｅｏｖｉｍｓＧＣＲＶ）基因组由
１１个ｄｓＲＮＡ片段组成…‘２…，不同的毒株问病毒基因组的总
分子量差异不大（约１５×１０６Ｄａ），而各片段分子量有所差异，按分子量大小，１１个片段可分为３组，即较大片段（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、中等片段（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）和较小片段（ｓｌ、Ｓ２、ｓ３、ｓ４、Ｓ５）。邱涛等＂０。通过对ＧｃＲＶ８７３基因
组研究，首次发现该病毒基因组外存在缺损性干扰颗粒的病毒亚基因组分，并从中筛选出２条缺损性干扰颗粒ｃＤＮＡ进行了序列分析，确定了其性质，因为其基因组只是亚基
因片段，为原基因组核酸片段经剪切、重排并被错误包裹
人病毒衣壳而形成，其自身属性决定其亚基因组中携带了众多正常病毒颗粒所没有的信息，使之成为研究该病毒复
制、装配过程以及调控信息的有利工具。
４．４病毒蛋白功能研究
方勤等＂１。对病毒基因所编码的蛋白功能进行了详细的
描述：（１）病毒核衣壳组分ＶＰ３和ＶＰ６，分别由基因片段
ＬＪ３和ｓ２编码，为核心衣壳的主要成分，它们在病毒的转录
与复制及病毒核衣壳形成中起着重要的作用。ＶＰ３蛋白序
列具有核苷酸结合位点，另外还具有解旋酶和ＲＮＡ三磷酸
酶／ＡＴＰ酶活性，其主要参与病毒转录过程中基因组负链的
解旋与帽化的能量供应，但ＶＰ３功能的发挥离不开ＶＰ６的帮助，其在病毒ＶＰ３核壳构象形成中具有十分重要的功能。另外研究还发现ＶＰ６有弱的ｄｓＲＮＡ结合能力。（２）病毒钉状物突起ＶＰｌ，ＶＰｌ蛋白五聚体蛋白为呼肠孤病毒【２基因片段编码，已证实ＶＰｌ蛋白与外衣壳蛋白ＶＰ７和ＶＰ５以及内衣壳ＶＰ３和ＶＰ２有很强的亲合作用与相互联系。序列及结构分析表明：ＶＰｌ蛋白具有鸟苷酸转移酶和２种甲基化酶活性，与ｍＲＮＡ５’末端的甲基化有关。（３）微量核心组分ＶＰ２和ＶＰ４，分别由基因片段Ｌ１和Ｍ１节段所编码。ＶＰ２为ＲＮＡ聚合酶，该蛋白位于内壳层５次对称轴通道孔洞处，参与新生ｍＲＮＡ的起始合成。ＶＰ４蛋白的作用可能为病毒复制中的一种调节蛋白，在病毒转录与复制过程中协同ＶＰ３共同决定ＮＴＰ酶活性。（４）病毒外衣壳结构蛋
白，Ｍ１、Ｓ４编码的病毒蛋白ＶＰ５和ＶＰ７构成病毒外衣壳组
分，ＶＰ５和ＶＰ７蛋白具有介导病毒粒子进入寄主细胞质的功能，此外ＶＰ５还可进行构象的改变，其作用是保证膜穿透。病毒粒子ＶＰ７具有协同ＶＰ：５蛋白通过构象变化行使膜
万 万方数据
方数据穿透功能。
５草鱼出血病的防治研究进展
５．１草鱼出血病的疫苗防治研究
草鱼出血病是一种病毒性鱼病，危害很大，感染此病后，当年草鱼死亡率一般为３０％～５０％，最高可达６０％一８０％。而免疫预防是该病最有效的防治方法之一。因此疫苗研制对该病的防治意义重大。对于草鱼出血病毒疫苗的
研制大致经历了组织灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等阶段，但都存在一定的缺陷口“。组织灭活疫苗须含足够
的病毒才能引起免疫应答，而大剂量（常是必须的）又可
引起局部或全身的反应。该疫苗不能进入ＭＨｃＩ类抗原呈递途径，因此不能有效的诱导ｃＴＬ反应，并且所获得的免疫性一般是短暂的，须激发注射。而减毒活疫苗由于存在
致病性、刺激性过强和回复致病性的潜在危险，而且活疫苗生产还可能造成污染，含有生产过程带来的潜在有毒物
质，因此在成本和生产技术上要求比较高。另外，上述２
种疫苗的主要缺点是需要冷冻保存，这样既增加成本又影响有效寿命，尤其是影响其在发展中国家的推广使用。亚
单位疫苗由于制备过程复杂，成本高，要求技术含量高，
因此也没有得到推广应用。而众所周知，理想的疫苗应具
备的特征有：安全、廉价、热稳定性好、含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前常规疫苗没有一个能完全满足上述标准。因此基因疫苗应运而生。
基因疫苗与传统疫苗相比有一些明显优点，主要表现在以下几个方面：（１）基因疫苗接种后，抗原蛋白在宿主细胞
内表达，加工处理过程与病原的自然感染类似，抗原呈递过程也相同，因而可以诱导机体产生细胞和体液免疫；（２）抗原基因在体内存在时间比较长，不断表达抗原蛋白，持续给免疫系统提供刺激，因而能够刺激机体产生较强和较持久的免疫应答；（３）可以将包含不同抗原基因的质粒混合进行联合免疫；（４）质粒载体没有免疫原性，可以反复使用。总之，基因疫苗以其抗原性强、保护时间长、改造方便、制备和运输方便而越来越受到人们的重视。成为一
种全新的免疫方式。３“。
就草鱼出血病的致病呼肠孤病毒来说，现在我们已经得到了其病毒的全部基因片段，并建立了相应的基因文库及基因表达多肽的图谱。王炜等Ⅲｏ曾对ＧｃＲＶ单个多肽进行了免疫原性研究，并筛选出ＶＰ６为免疫原性强的多肽片段，这说明单个多肽作为抗原能刺激机体中和抗体的产生。而我们已经知道了编码这个多肽的基因序列，因此完全可以通过将这段序列与载体结合制成基因疫苗来免疫草鱼。另外，还可将不同地区发现的毒株中免疫原性强的多肽片段制成联合免疫疫苗，以提高草鱼对不同毒株的抗性。相信这将是非常有意义并且实用价值的研究内容。可为疫苗
７０
南方水产第２卷
的研究方面开拓一条新的思路。但由于基因疫苗的发展刚
处于起始阶段，对于基因疫苗在鱼体内的作用和代谢机制还不完全清楚，其便捷实用的使用方法和适宜剂量也需要
实验的深入研究。另外，对于基因疫苗中所用的抗原基因的分离技术还很不成熟，抗原表达控制元件的优选也有待于进一步的探索。但可以肯定，未来更多的高效安全、使用方便的基因疫苗的制备和大规模生产，必将能够促进我国草鱼养殖业的发展。
５．２草鱼出血病的中草药防治
中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、资源丰富以及性能多样化等优点，在防治鱼病中，除了兼
有药性和营养性外，还具有提高水产动物生产性能和饲料
利用率的功效。因此应用中草药防治鱼病越来越受到人们
的关注，并总结筛选出许多在生产应用中行之有效的单方、验方¨””Ｊ。在治疗及预防草鱼出血病中应用的最多的中草药有：大黄、黄柏、黄芩、大蒜等。袁良萃”刊在总结前人
治疗草鱼出血病经验的基础上，经过反复实践，利用当归、
大黄、板兰根、赤芍、虎仗等十几种中草药剂制成方剂
“景珠牌止血散”，用于防治草鱼出血病，调查结果表明，
有效率在９５％以上，治愈率占９０％以上。是中草药在防治
草鱼出血病中很好的应用例子。
中草药虽然在防治鱼病方面有一定的功效，但在实际
应用中也存在许多问题，集中表现在以下几个方面：（１）
药材质量不稳定，由于季节、产地、炮制方法等不同，同一种中草药，其有效成分含量差异很大，有时同样的配方却疗效不同。（２）加工工艺原始，目前中草药的加工大多
以原药粉碎或切碎煎熬，其配方多为粗制型产品，剂量使用偏大，适口性也差，不利于规模化生产、应用。应采取先进的生产工艺，对中草药进行提取、精制，使其向微量化、系列化、专用型方向发展。（４）对渔用中草药的药效、药理方面研究不足，对其有效成分难以确认，使用的剂量
没有严格的标准。因此应加强在这方面的研究，加强对中
草药进行提纯和治疗机理方面的研究，充分合理开发我国的中草药资源，以弥补在中草药研究上的空缺。使中草药
在防治鱼病方面发挥其应有的作用。
５．３草鱼出血病的其它防治方法研究
章怀云等‘３８Ｊ采用外源ＤＮＡ处理方法，将鲤鱼精液、
肝脏的总ＤＮＡ以精子作载体处理草鱼受精卵，获得了数批
经外源ＤＮＡ处理的草鱼群体，并证明该群体在自然养殖条
件下显示出一定的抗草鱼出血病的症状。当人工感染时，其抗病力比普通鱼强３．９８～５．８９倍。潜伏期长１～２ｄ，死
鱼持续时间短１～２ｄ。其具体机制尚待进一步研究。
干扰素是至今发现的最为理想的一种抗病毒生物活性物质，是一种主要细胞调节因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能‘３…。目前研究较为活跃，邵建忠等㈣１采用
万 万方数据
方数据细胞病变抑制法测定了病毒诱导前后草鱼外周血中干扰素的活性变化，结果表明经病毒诱导的草鱼血清中出现明显
的干扰素抗病毒活性，并对干扰素活性因子进行了理化性
质的研究。ＧｃＲＶ激活寄主抗病毒防御机制是通过诱导合成和分泌干扰素来实现的，对鱼类干扰素研究不仅为干扰
素的分子进化和比较免疫学等基础研究提供资料，具有重要的理论意义，而且在鱼病防治中有广阔的应用前景’１“。特别是通过草鱼干扰素研究有可能为我国水产养殖中的草鱼出血病防治开辟新的途径。
近年来，国外学者采用化学合成法或基因工程法构建随机肽库，研究蛋白质之间的分子识别、酶与底物的结合、抗原与抗体的相互作用，并使之成为一门新的快速有效、潜力巨大的技术，广泛应用于与分子识别有关的领域，如：
抗生素筛选、酶抑制剂筛选、小分子药物设计、重组疫苗
设计及病毒高亲和力的抗体、肿瘤治疗及免疫治疗，由于肽库技术具有如此重要的理论价值和应用前景，作为一项
具有极大潜力的抗病毒新策略，越来越受到重视。王冰等‘４叫报道了从随机肽库中筛选出与草鱼出血病病毒颗粒特异性结合的短肽分子，并能有效的中和病毒、阻止病毒感染。这一新的途径提示了应用肽库技术在体外筛选抗病毒
制剂的可能性，并为高效抗病毒短肽制剂的及小分子抗病
毒药物的设计打下基础。
参考文献：
［１］毛树坚，邵建忠，杭绮，等．草鱼出血病的病原研究［Ｊ］．水
产学报，１９８９，１３（１）：１—４．
［２］倪达书．我国鱼病学研究现状及其发展前景［Ｊ］．现代渔业信
息，１９９４，９（３）：１—４．
［３］中国科学院水生生物研究所三室病毒组．草鱼出血病病原的研
究［Ｊ］．水生生物学集刊，１９７８，６（３）：３２ｌ一３２９．
［４］方勤．草鱼呼肠孤病毒的三维结构与衣壳蛋白特性［Ｊ］．中国
科学，２００５，３５（３）：２３１—２３７．
［５］陈延，王炜，柯丽华，等．草鱼出血病病毒的糖蛋白和结构多
肽的抗原性［Ｊ］．病毒学报，１９９２，３（１）：５７—６１．
［６］曾令兵，袁明雄．草鱼出血病病毒高滴度培养方法的研究
［Ｊ］．淡水渔业，２０００，３０（４）：４０一４１．
［７］张义兵，石耀华，桂建芳．鱼类培养细胞抗病毒基因差减ｃＤＮＡ
文库的构建［Ｊ］．水生生物学报，２００≯，２７（２）：１１３一１１８．［８］丁清泉，余兰芬，王学兰，等．草鱼出血病病鱼主要器官的超
薄切片观察及感染力的比较［Ｊ］．水产学报，１９９０，１４（１）：
６６—６９．
［９］邵建忠，项黎新，李亚南，等．应用Ｄｏｔ—ＥＬＩｓＡ技术检测草鱼
出血病病毒的研究［Ｊ］．水产学报，１９９６，２０（１）：６一１１．
［１０］李军，王铁辉，周立冉，等．应用逆转录聚合酶链反应直接
检测草鱼出血病病鱼组织的研究［Ｊ］．水产学报，１９９７，２１（２）：１７５—１７９．
第３期王方华等：草鱼病毒性出血病研究进展
７１
［１１］李军，王铁辉，陆仁后，等．草鱼出血病病毒的研究进展
［Ｊ］．海洋与湖沼，１９９９，３０（４）：４４５—４５２．
［１２］李亚南，毛树坚．紫外线诱变建立草鱼抗出血病病原病毒的
ＡＨｚｃ８８细胞株［Ｊ］．水产学报，１９９０，１４（２）：８９—９３．
［１３］郑德崇，黄琪琰，赵立勤，等．草鱼出血病的电镜观察［Ｊ］．
水产学报，１９９１，１５（４）：３１７—３２０．
［１４］方勤，朱作言．呼肠弧病毒结构与功能研究进展［Ｊ］．病毒
学报，２００３，９（４）：３８ｌ一３８４．
［１５］李军，王铁辉，周立冉，等．两种草鱼出血病病毒的比较
［Ｊ］．中国水产科学，１９９８，５（３）：１１５一１１８．
［１６］方勤，肖调义，清泉，等．草鱼呼肠孤病毒新分离株
（ＧｃＲＶ９９１）的病毒学特性分析［Ｊ］．中国病毒学，２００２，１７
（２）：１７８—１８１．
［１７］曾令兵，贺路，左文功．草鱼出血病病毒８５４株的理化、生物
学特性及基因组结构［Ｊ］．水产学报，１９９８，２２（３）：２７９—
２８２．
［１８］王炜，蔡宜权，方勤，等．草鱼出血病病毒多肽的基因定位
［Ｊ］．中国病毒学，１９９４，９（４）：３５６—３６１．
［１９］方勤，丁清泉，汪亚平，等．两株水生呼肠孤病毒部分特性
的比较［Ｊ］．中国病毒学，２００３，１８（５）：４６４—４６７．
［２０］ｚＨＡＮＧＱ，ＲｕＡＮ
Ｈ，ＬＩ
ｚ，ｅｔ
ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｍｓｓ
ｃａｒｐ
ｈｅｍｏｒ－ｒｈａｇｅ
ｖｉｒｕｓ（ＧｃＨＶ）ｆｍｍ
Ｖｉｅｔｎａｍ
ａＩｌｄ
ｃｏｍｐ耐ｓｏｎ
ｗｉｔｈＧｃＨＶｓｔｒａｉｎ
ｆｍｍ
Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．ＨｉｇｈＴｅｃｈＬ￡ｔ，２００３，９（２）：７—１３．
［２１］方勤，肖调义，李旅，等．四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞
感染特性比较研究［Ｊ］．中国病毒学，２００２，１７（２）：１８２—
１８４．
［２２］ＬＪＪ，ｗＡＮＧＴ，ＬＩｕ
Ｈ，ｅｔ
ａ１．ＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｈａｅｍｏＨｈａｇｉｃ
ｖｉｎｌｓ
ｏｆ
ｇｒａｓｓ
ｃａｒｐ（ＧｃＨＶ）ｂａｓｅｄｏｎ
ｔｈｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒ锄ｓｃｄｐｔｉｏｎｐｏｌｙ－
ｍｅｍｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｄｉｓ
Ａｑｕａｔ
０氇，１９９７，２９（１）：７一
１２．
［２３］方勤，田静．草鱼呼肠孤病毒（ＧｃＲＶ）部分基因片段ｃＤＮＡ
文库的构建［Ｊ］．中国病毒学，２０００，５（１）：７８—８２．［２４］方勤，丁清泉．呼肠孤病毒内源性转录的结构基础［Ｊ］．中国
病毒学，２００４，１９（５）：５３５—５３９．
［２５］张保焰，柯丽华．草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究
［Ｊ］．中国病毒学，１９９３，８（２）：１８５—１８８．
［２６］方勤，朱作言．草鱼呼肠孤病毒ＲＮＡ聚合酶基因功能区在原
核细胞中的表达［Ｊ］．病毒学报，２００２，１８（１）：８６—８８．
万 万方数据
方数据［２７］方勤，丁清泉，汪亚平，等．草鱼呼肠孤病毒ＲＮＡ聚合酶基
因的表达与产物纯化［Ｊ］．中国病毒学，２００３，１８（２）：１６９
—１７３．
［２８］ＱｌｕＴ，ＬｕＲＨ，ｚＨＡＮＧＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
０ｆＲＮＡ
ｓｅｇｍｅｎｔ
ｓ９ｏｆｇｒａｓｓ
ｃａｒｐｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｖｉｍｓ（ＧｃＨＶ）［Ｊ］．
Ａｑｕａｃ，２００１，２０３（１／２）１—７．
［２９］田静，邹桂平，方勤．草鱼出血病病毒基因组的ｃＤＮＡ合成、
克隆及部分序列分析［Ｊ］．中国病毒学，１９９９，４（１）：８７—
９２．
［３０］邱涛．草鱼出血病病毒８７３株基因组外发现缺损性干扰颗粒的
亚基因组成份［Ｊ］．病毒学报，２００１，１７（２）：１４０一１４３．［３１］方勤，朱作言．水生呼肠孤病毒研究进展［Ｊ］．中国病毒学，
２００３，１８（１）：８２—８６．
［３２］许淑英，李焕林，郑国成，等．草鱼出血病细胞培养弱毒疫
苗的制备及其免疫效果［Ｊ］．水产学报，１９９４，１８（２）：１ｌＯ
一１１５．
［３３］姜勋平．基因免疫的原理和方法［Ｍ］．北京：科学出版社，
２００４：１—６．
［３４］王炜，陈延，柯丽华，等．草鱼出血病病毒武汉南湖株的精
细结构与基因组及多肽的研究［Ｊ］．病毒学报，１９９０，６：４４
—４９
［３５］江河，戚少燕，陈宇，等．特异化饵料免疫预防草鱼出血病
的效果［Ｊ］．安徽农业科学，２００ｌ，２９（５）：６７６—６７７．［３６］汪长友．中草药在鱼病防治中的应用［Ｊ］．水产养殖，２００３，
２４（１）：４４—４６．
［３７］袁良萃．中草药防治草鱼出血病新技术［Ｊ］．中国水产，２０００
（１１）：７８．
［３８］章怀云，萧克宇，陈韬，等．外源ＤＮＡ处理的草鱼对草鱼出
血病毒的抗性观察［Ｊ］．湖南农业大学学报，１９９７，２３（２）：
１５４—１５７．
［３９］贾方钧，王铁辉，张义兵，等．干扰素防治草鱼出血病的效
果初探［Ｊ］．水产科学，２０００，１９（４）：１—４．
［４０］邵建忠，钱凯先，项黎新，等．病毒诱导草鱼产生干扰素活
性因子的研究［Ｊ］．病毒学报，１９９８，１４（４）：３４６—３５１．［４１］王冰，柯丽华，江红，等．从随机噬菌体肽库中筛选抗草鱼
出血病毒多肽的研究［Ｊ］．中国病毒学，１９９８，３（４）：３５ｌ
一３５６．
草鱼病毒性出血病研究进展
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
王方华， 李安兴， WANG Fanghua， LI Anxing中山大学生命科学学院,广东,广州,510275南方水产
SOUTH CHINA SEA FISHERIES SCIENCE2006,2(3)7次
参考文献(41条)
1. 陈延;王炜;柯丽华 草鱼出血病病毒的糖蛋白和结构多肽的抗原性[期刊论文]-病毒学报 1992(01)2. 方勤 草鱼呼肠孤病毒的三维结构与衣壳蛋白特性[期刊论文]-中国科学C辑 2005(03)3. 郑德崇;黄琪琰;赵立勤 草鱼出血病的电镜观察 1991(04)
4. 李亚南;毛树坚 紫外线诱变建立草鱼抗出血病病原病毒的AHZC88细胞株 1990(02)
5. 王冰;柯丽华;江红 从随机噬菌体肽库中筛选抗草鱼出血病毒多肽的研究[期刊论文]-中国病毒学 1998(04)6. 邵建忠;钱凯先;项黎新 病毒诱导草鱼产生干扰素活性因子的研究[期刊论文]-病毒学报 1998(04)7. 贾方钧;王铁辉;张义兵 干扰素防治草鱼出血病的效果初探[期刊论文]-水产科学 2000(04)8. 章怀云;萧克宇;陈韬 外源DNA处理的草鱼对草鱼出血病毒的抗性观察 1997(02)9. 袁良萃 中草药防治草鱼出血病新技术[期刊论文]-中国水产 2000(11)10. 汪长友 中草药在鱼病防治中的应用[期刊论文]-水产养殖 2003(01)
11. 江河;戚少燕;陈宇 特异化饵料免疫预防草鱼出血病的效果[期刊论文]-安徽农业科学 2001(05)
12. 王炜;陈延;柯丽华 草鱼出血病病毒武汉南湖株的精细结构与基因组及多肽的研究[期刊论文]-病毒学报 199013. 姜勋平 基因免疫的原理和方法 2004
14. 许淑英;李焕林;郑国成 草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果 1994(02)15. 方勤;朱作言 水生呼肠孤病毒研究进展[期刊论文]-中国病毒学 2003(01)
16. 邱涛 草鱼出血病病毒873株基因组外发现缺损性干扰颗粒的亚基因组成份[期刊论文]-病毒学报 2001(02)17. 邵建忠;项黎新;李亚南 应用Dot-ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究 1996(01)
18. 丁清泉;余兰芬;王学兰 草鱼出血病病鱼主要器官的超薄切片观察及感染力的比较 1990(01)
19. 张义兵;石耀华;桂建芳 鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建[期刊论文]-水生生物学报 2003(02)20. 曾令兵;袁明雄 草鱼出血病病毒高滴度培养方法的研究[期刊论文]-淡水渔业 2000(04)21. 中国科学院水生生物研究所三室病毒组 草鱼出血病病原的研究 1978(03)22. 倪达书 我国鱼病学研究现状及其发展前景 1994(03)
23. 田静;邹桂平;方勤 草鱼出血病病毒基因组的cDNA合成、克隆及部分序列分析[期刊论文]-中国病毒学 1999(01)24. QIU T;LU R H;ZHANG J The molecular characterization of RNA segment S9 of grass carp hemorrhagevirus (GCHV)[外文期刊] 2001(1-2)
25. 方勤;丁清泉;汪亚平 草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化[期刊论文]-中国病毒学 2003(02)26. 方勤;朱作言 草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达[期刊论文]-病毒学报 2002(01)27. 张保焰;柯丽华 草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究[期刊论文]-中国病毒学 1993(02)28. 方勤;丁清泉 呼肠孤病毒内源性转录的结构基础[期刊论文]-中国病毒学 2004(05)
29. 方勤;田静 草鱼呼肠孤病毒(GCRV)部分基因片段cDNA文库的构建[期刊论文]-中国病毒学 2000(01)30. LI J;WANG T;LIU H A detection method of haemorrhagic virus of grass carp (GCHV) based on the
reverse transcription polymerase chain reaction 1997(01)
31. 方勤;肖调义;李旅 四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究[期刊论文]-中国病毒学 2002(02)32. ZHANG Q;RUAN H;LI Z Detection of grass carp hemorrhage virus (GCHV) from Vietnam and comparisonwith GCHV strain from China[外文期刊] 2003(02)
33. 方勤;丁清泉;汪亚平 两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较[期刊论文]-中国病毒学 2003(05)34. 王炜;蔡宜权;方勤 草鱼出血病病毒多肽的基因定位[期刊论文]-中国病毒学 1994(04)35. 曾令兵;贺路;左文功 草鱼出血病病毒854株的理化、生物学特性及基因组结构 1998(03)
36. 方勤;肖调义;清泉 草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV991)的病毒学特性分析[期刊论文]-中国病毒学 2002(02)37. 李军;王铁辉;周立冉 两种草鱼出血病病毒的比较 1998(03)
38. 方勤;朱作言 呼肠弧病毒结构与功能研究进展[期刊论文]-病毒学报 2003(04)39. 李军;王铁辉;陆仁后 草鱼出血病病毒的研究进展[期刊论文]-海洋与湖沼 1999(04)
40. 李军;王铁辉;周立冉 应用逆转录聚合酶链反应直接检测草鱼出血病病鱼组织的研究 1997(02)41. 毛树坚;邵建忠;杭绮 草鱼出血病的病原研究 1989(01)
引证文献(7条)
1. 周勇. 曾令兵. 范玉顶. 罗晓松. 徐进. 肖艺 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建[期刊论文]-中国水产科学 2011(1)
2. 郭帅. 李家乐. 吕利群 草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策[期刊论文]-渔业现代化 2010(1)
3. 徐洋. 郝贵杰. 沈锦玉. 郑善坚. 潘晓艺. 姚嘉赟. 尹文林 两株草鱼呼肠孤病毒江西株的分离与鉴定[期刊论文]-淡水渔业 2010(3)
4. 张彬. 陈福艳. 黄婷. 梁万文. 余晓丽. 陈明. 雷爱莹 广西南宁市和崇左市草鱼养殖水体水质定点监测及分析[期刊论文]-广西农业科学 2009(11)
5. 周勇. 范玉顶. 徐进. 李艳秋. 肖艺. 曾令兵 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建[期刊论文]-淡水渔业 2009(4)
6. 高晓. 李兵 草鱼出血病及其防治技术[期刊论文]-现代农业科技 2008(20)
7. 马贵华. 陈道印. 刘六英. 刘正有. 李志强 草鱼出血病的免疫学研究进展[期刊论文]-渔业现代化 2008(1)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_nfsc200603012.aspx